基于网络药理-分子对接方法研究翅果菊抗抑郁的作用机制

陈奇剑 李春燕 肖 先 刘晓龙 薛金涛▲

1.新乡医学院药学院，河南新乡 453002；2.新乡医学院三全学院生物与基础医学实验教学中心，河南新乡 453003

作为一个重大公共卫生问题，抑郁症具有高自杀率、高自残率和高复发率的特点。经典的抗抑郁药物起效慢、疗效较差，因此寻找快速、有效和安全的药物用于抑郁症的治疗为当前研究的热点[1-6]。翅果菊（pterocypsela elata）为菊科植物翅果菊Pterocypsela elata（Hemsl.）Shih的根或全草。本研究从翅果菊中共分离得到18个活性成分，其中莴苣苷B（lactuside B，LB）是一种新型化合物，前期药理学研究表明LB和翅果菊具有良好的抗抑郁、改善记忆、抗脑缺血和抗心肌缺血作用[7-10]。鉴于此，翅果菊和LB在抑郁症的治疗中具有广阔的应用前景，但其作用机制尚不清楚，本研究拟采用网络药理学和分子对接方法研究翅果菊发挥抗抑郁作用的主要活性成分和作用机制。

1 资料与方法

1.1 软件

ChemBioOffice软件（ChemBioDraw和ChemBio3D，Ultra 14.0），Open Babel GUI软件（Version 2.4.1），Autodock Vina软件（Version 1.1.2），PyMoL软件（Version 1.7.2.1）和Autodock Tools软件（Version 1.5.6）。

1.2 数据库

DrugBank数 据 库（Version 5.1.3，https://www.drugbank.ca/），Batman数 据 库 （http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php/Home/Index/index），String数据库 （Version 11.0，http://www.string-db.org/）和The Protein Data Bank（PDB）数 据 库（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）。

1.3 网络药理学

整理课题组从翅果菊中分离得到的化学分子[7-10]，在ChemBioOffice软件中分别画出各化合物化学结构式，以CDX格式保存。利用Open Babel GUI软件将CDX格式文件转换为Inchi格式，并上传至Batman数据库获得各成分的作用靶点，选择与化学成分拟合度高（得分值Z’-score ≥ 23）的靶点进行下一步的分析。在DrugBank数据库中以“Depression”（抑郁症）为关键词进行检索，筛选出作用于抑郁症的活性靶点。将Batman数据库中获得的化学成分作用靶点与DrugBank数据库中的抗抑郁症的活性靶点进行交叉对比，筛选翅果菊抗抑郁症的活性成分和作用靶点。在String数据库，将物种限定为“Homo sapiens”，对筛选得到的靶点进行基因功能注释（gene ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析，以对翅果菊的功能分布和通路注释进行研究分析。

1.4 分子对接

采用ChemBioOffice软件的ChemBio3D功能将LB和guaianolide Ⅰ（Ⅰ）化学结构转化成三维格式，并在PDB数据库检索并下载目的作用靶点的三维蛋白结构，利用Autodock Tools软件对蛋白质进行常规处理（加氢、去水、加电荷等），并将蛋白和药物活性成分转化为pdqpt格式文件保存。采用Autodock Tools软件进行分子对接参数的设置，并进一步使用Autodock Vina软件进行分子对接。最后使用PyMoL软件处理对接结果。

2 结果

2.1 活性成分整理

本研究前期研究中从翅果菊中提取分离得到18个 化 学 成 分[7-10]，分 别 是LB，11β，13-二氢莴苣内酯乙酸酯，11β,13-二氢莴苣内酯，GI，guaianolide Ⅱ，guaianolide Ⅲ，（24R）-5α-豆甾-7，22（E）-二烯-3α-醇，齐墩果酸，β-香树脂），β-谷甾醇，胡萝卜苷，3，3′，4-三甲氧基鞣花酸，硬脂酸，3-oxo-friedlane，stigmasterol，aralia cerebroside，ursa-12-ene-11-one-3-oloctocosate和hexacosanoic acid，其中LB从翅果菊中分离得到一种新型化合物。

2.2 抗抑郁活性成分和作用靶点的筛选

通过统计分析Batman数据库筛选得到的活性靶点，翅果菊18个活性成分共得到409个作用靶点。在DrugBank数据库中共检索得到292个抗抑郁作用靶点。交叉对比化学成分的作用靶点与抗抑郁作用靶点，筛选得到1作用靶点γ-氨基丁酸受体亚单位β-3（γ-aminobutyric acid receptor subunit beta-3，GABRB3，ID：P28472），翅果菊中共有2个药效活性成分（LB和GI）作用于该靶点。

2.3 GO富集分析和KEGG通路分析

在上述对翅果菊活性成分和作用靶点筛选的基础上，采用GO富集分析和KEGG代谢通路分析进一步进行网络药理学研究。GO富集分析主要包括生物过程、分子功能和细胞组分3个部分，并以P.Adust分析某一指标和功能对富集的重要性，P.Adust值<0.05表示相应指标具有显著性影响，P.Adust值越小，表示越具有显著性影响，统计分析中一般取其对数的负值：-log10（P. Adust），故其值越大，表示越具有显著性。

图1A，GO富集分析共发现有显著性影响的生物过程17个，其中显著性意义较大的有γ-氨基丁酸信号通路（P.Adust=8.11E-26）、氯离子跨膜转运（P.Adust=8.05E-21）和G蛋白耦联受体信号通路（P.Adust=1.05E-12）等。图1B，共发现有显著性影响的分子功能7个，其中显著性意义较大的有GABA-A受体活性（P.Adust = 4.55E-27）、细胞外配体门控离子通道活性（P.Adust=2.67E-22）和氯离子通道活性（P.Adust=3.64E-22）等。图1C，共发现有显著性影响的细胞组分5个，其中显著性意义较大的有氯离子通道复合体（P.Adust=1.08E-23）、GABA-A受 体复 合物（P.Adust =1.08E-23）和 突触后膜（P.Adust=1.69E-17）等。图2，KEGG通路分析结果表明，翅果菊活性成分作用于抑郁症的KEGG通路中有显著性影响的共有7个，其中显著性意义较大的有尼古丁成瘾（P.Adust=3.47E-25）、GABA能 突 触（P.Adust=2.36E-22）和 吗 啡 成 瘾（P.Adust=2.36E-22）等。

图1 作用靶点GO富集分析结果

图2 作用靶点的KEGG通路分析结果

2.4 分子对接

分子对接方法广泛应用于药物活性分子与靶蛋白的对接分析[11-16]。表1在PDB数据库以GA B R B 3为关键词检索相关蛋白受体，共得到11个蛋白受体，将LB、GI分别与11个蛋白受体文件进行分子对接。一般认为分子与蛋白的结合自由能（Affinity）越小，两者结合越紧密牢固，结合能<-5.0 kcal/mol时有较好的结合活性，结合能<-7.0 kcal/mol时提示有强烈的结合活性[11-12]。表1 LB与除7A5V外的其余10个蛋白受体均具有强烈的结合活性（Affinity<-7.0 kcal/mol），其 中 与6I53的 结 合活性最强（Affinity=-9.2 kcal/mol），其分子对接结果如图3A，LB与6I53的结合位点在其蛋白内部的空腔中（图中数字为LB与6I53中相近的氨基酸位点的分子间距离，单位：Å）。G I与11个蛋白受体均具有强烈的结合活性（Affinity<-7.0 kcal/mol），其 中 与6I53和6HUG的结合活性最强，结合自由能均为9.5 kcal/mol，其对接结果见图3B和图3C，GI与6I53和6HUG的结合位点均在其蛋白外侧的空腔中。

表1 活性成分和作用靶点对接结果

图3 活性成分与靶点对接结果

3 讨论

网络药理学结果表明，在翅果菊18个活性成分中筛选得到2个活性成分（LB和GI）及其作用靶点GABRB3，并采用分子对接技术对LB和GI与GABRB3进行了对接验证，结果表明，LB和GI均与GABRB3的11个蛋白受体有良好的结合能力。GABRB3是γ-氨基丁酸A（γ-aminobutyric acid A，GABA）受体中功能显著的一种，而GABA是中枢神经系统中最重要的抑制性神经递质之一，研究表明GABRB3与多种神经类疾病有关，其异常表达可引起包括抑郁症等多种精神疾病[17-18]。辛军彩[17]发现GABRB3基因是抑郁症的一种遗传相关基因。张嫱[18]研究发现GABRB3等基因的异常表达可能是导致抑郁症的中枢机制之一，纠正该基因的异常表达则对抑郁症具有良好的干预作用。

GO富集和KEGG通路分析表明，翅果菊及其活性成分的作用机制与γ-氨基丁酸信号通路、GABA-A受体活性、GABA-A受体复合体和GABA能突触等联系密切，可见GABA的水平和功能对翅果菊及其活性成分发挥抗抑郁作用具有重要意义。刘向六等[19]对抑郁症大鼠强迫游泳模型中研究发现，氯胺酮的抗抑郁作用与大鼠前额皮层 GABA下调有关。周月等[20]采用GABA和茶氨酸联合干预抑郁症大鼠，给药后对抑郁症有一定改善作用。

本研究从分子网络层面揭示LB在抑郁症的治疗中具有良好的应用前景，并分析了作用靶点和信号通路，为其作用机制的深入研究和药理学研究应用提供了研究依据和线索。