孤独症谱系障碍患儿的血清肠道屏障功能指标水平及临床意义▲

林 兵 王倩倩 阳 静 胡炜倩 张圳甜 邵建忠 张和平 朱翠凤

(1 南方医科大学深圳医院临床营养科，广东省深圳市 518101； 2 湖州聚疗康复医疗中心有限公司，浙江省湖州市 313000； 3 内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室,农业农村部奶制品加工重点实验室,内蒙古自治区乳品生物技术与工程重点实验室,内蒙古呼和浩特市 010018)

孤独症谱系障碍(autistic spectrum disorder，ASD)患儿的主要特征为存在社交、言语和非言语沟通上的困难，以及刻板或重复行为，多数病例的发育异常始于婴幼儿期，在5岁前就已表现出明显的症状，部分可持续至成年。该病给患儿家庭带来重大的精神负担和经济压力，受到社会各界的广泛关注。近年来，ASD的发病率一直处于快速增长的状态，根据美国疾病控制与预防中心公布的数据，2010年美国ASD患病率为1.47%[1]， 2021年时已达到2.27%[2]。目前我国仍缺乏ASD患病率的官方统计报告，2018年一项Meta分析结果显示，我国ASD的患病率约为0.39%，且处于快速增长阶段[3]。

以往有关ASD的研究主要集中在基因遗传方面，然而近年来的研究表明环境因素对ASD的影响更大，包括饮食因素、肠道菌群变化、生命早期暴露于有毒有害物质等都可能对ASD的发生、发展产生影响[4]。有学者发现近一半的ASD患儿伴有胃肠道疾病症状，主要表现为腹泻、腹胀、便秘、胃食管反流等，且ASD的严重程度与胃肠功能障碍严重程度往往呈正相关[5]。正常情况下，肠道具有屏障功能，可有效地阻挡肠道内寄生菌向肠腔外组织、器官移位，防止机体受内源性微生物及其分泌毒素的侵害。当肠道屏障功能受损或异常时，如出现缺血再灌注损伤、氧化应激、肠道微生物群失调、细胞自噬、不良遗传和环境因素等影响，则需要使用合适的指标来准确评估肠道屏障的损伤情况及程度[6]。近年来，血清二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)、D-乳酸和细菌内毒素作为评估肠道屏障功能的指标，已逐渐得到重视。本研究通过比较ASD患儿和正常同龄儿童血清的DAO、D-乳酸和细菌内毒素水平，来评估ASD儿童的肠道屏障功能及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 纳入于2021年1～10月期间，因合并生长发育迟缓等问题至南方医科大学深圳医院临床营养科门诊和湖州聚疗康复医疗中心就诊的ASD患者(ASD组)。纳入标准：(1)由具有资质的儿科或康复科医师根据美国精神病学会出版的《精神障碍诊断与统计手册第5版》[2]标准诊断为ASD；(2)年龄在3～16周岁之间，性别不限；(3)无已知的免疫缺陷性疾病。排除标准：(1)严重营养不良的患儿，诊断参考2009年我国九市儿童生长发育调查结果的标准[7]，体重低于同性别、同年龄儿童平均体重-2个标准差；(2)患有需要立即治疗(或危及生命)的严重胃肠道疾病者；(3)有严重过敏史的患儿；(4)肾功能不全和肝功能障碍的患儿；(5)患有炎症性肠病、肠梗阻、肠穿孔、肠出血、乳糜泻、肠易激综合征、嗜酸性粒细胞增多症、食管炎、嗜酸细胞性胃肠炎或类似病症的患儿；(6)具有严重感知觉或运动障碍的患儿。选择同期因偏食等问题至营养科门诊就诊的3～16周岁非孤独症儿童作为对照组。纳入标准：生长发育正常，即身高/体重均在同年龄、同性别儿童平均身高/体重±2个标准差范围内。排除标准同ASD组。共纳入ASD组患儿19例，正常对照组儿童38例，两组性别、年龄、食物和药物过敏史、近1个月抗生素和益生菌使用史比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表1。所有调查对象的家属均签署了知情同意书，本项目通过了南方医科大学深圳医院医学伦理委员会的审查(批号：NYSZYYEC20200045)。

表1 两组儿童一般情况的比较

1.2 临床资料的收集 包括年龄、性别、身高、体重、食物和药物过敏史、各种疾病史(遗传性疾病、血液系统疾病、肾病)、近1个月的用药史等。

1.3 肠道屏障功能的检测 空腹8 h以上后采集静脉血5 mL，用抗凝管于4 ℃冷藏备检。检测时先以3 500 r/min的速度离心6 min，取上层血清20 μL，采用肠屏障功能生化检测仪(北京中生金域诊断技术股份有限公司，型号：JY-DLT)和DAO/D-乳酸/细菌内毒素试剂盒(北京中生金域诊断技术有限公司，批号：09210101)，由检验师专人进行血清DAO、D-乳酸、细菌内毒素水平的测定。

1.4 ASD患儿病情严重程度的评估 采用儿童孤独症评定量表(Childhood Autism Rating Scale，CARS)[8]进行评估。该量表由15项内容组成，每项按1～4级评分，最高60分，总分≥30分可诊断为ASD，其中≥30分但<36分为轻-中度ASD，≥36分为重度ASD。

1.5 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料均服从正态分布，以(x±s)表示，方差齐时采用t检验进行组间比较，方差不齐时采用t′检验进行组间比较；采用Pearson检验进行相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组血清DAO、D-乳酸和细菌内毒素水平 与对照组相比，ASD组血清D-乳酸水平更高(P<0.05)，而两组血清DAO和细菌内毒素水平差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 两组血清DAO、D-乳酸和细菌内毒素水平的比较(x±s)

2.2 ASD患儿病情严重程度与血清DAO、D-乳酸、细菌内毒素水平的相关性 与轻-中度ASD患儿相比，重度ASD患儿的血清D-乳酸水平更高(P<0.05)，而不同严重程度ASD患儿之间的血清DAO和细菌内毒素水平差异无统计学意义(均P>0.05)，见表3。在ASD组中，CARS评分与血清D-乳酸水平呈正相关(r=0.555，P=0.014)，与血清DOA、细菌内毒素水平之间无相关性(r=-0.052、0.075，P=0.832、0.760)。

表3 不同病情严重程度ASD患者血清DAO、D-乳酸和细菌内毒素水平的比较(x±s)

3 讨 论

肠道作为人体的“第二大脑”，可影响大脑认知和神经系统的发育。常见的胃肠道症状可能与ASD的发生、发展密切相关，这是因为肠道功能异常可以通过肠道微生物-肠-脑轴影响肠道神经系统、神经内分泌系统和免疫系统等，从而间接地调控大脑功能，5-羟色胺、细菌内毒素等有毒有害物质穿过肠道屏障后，可直接作用于大脑或引发炎症因子分泌间接作用于大脑，最终诱发神经和社交功能障碍[9-10]。

目前，评估肠道屏障功能的手段主要有血清DAO、D-乳酸、内毒素水平测定，以及肠道黏膜组织病理学检测、血培养查找致病菌、糖分子探针检测肠黏膜通透性等[11]。其中，DAO是小肠黏膜上皮细胞细胞质中的一种高活性酶，正常情况下在其他组织和外周血中含量极低；如果肠道黏膜细胞受损或坏死，细胞内DAO会释放至血液中，导致血清DAO水平增加，因此其是评价肠道屏障功能非常敏感的指标。血清D-乳酸主要来自肠道内细菌无氧代谢，其他组织器官很少分泌，正常情况下其水平较低，但在缺血、缺氧条件下D-乳酸水平明显升高，并穿过受损的肠黏膜，而人体自身缺少D-乳酸分解代谢酶，因此其浓度较为稳定，临床可将其用于评估肠道缺血缺氧情况和肠黏膜通透性的变化。内毒素主要由革兰阴性菌死亡裂解产生，是革兰阴性菌细胞壁中的脂多糖。当肠道屏障功能受损导致肠黏膜通透性增加时，内毒素可通过肠黏膜进入血液系统，形成内毒素血症。上述3种实验室指标是评价患者肠道屏障功能的快捷经济指标，近年来在重症、顽固性腹泻等患者中逐渐得到重视和应用[12-13]。国内有研究报告，成人抑郁症患者血清中的D-乳酸和细菌内毒素水平升高，且两者水平与患者的年龄增长呈正相关[14]。但目前上述3种实验室指标在ASD患儿中的相关研究仍较少。

本研究结果显示，ASD组血清D-乳酸水平高于正常对照组(P<0.05)，但是两组的血清DAO和细菌内毒素水平之间差异无统计学意义(均P>0.05)。这表明ASD患儿可能主要存在肠道缺血缺氧和黏膜通透性改变的问题，而没有急性的肠黏膜坏死或肠道革兰阴性菌显著增加的情况[15]。亚组分析提示重度ASD患儿的血清D-乳酸水平较轻-中度ASD患儿更高，ASD患儿的CARS评分与血清D-乳酸水平呈正相关(均P<0.05)，表明ASD患儿病情越重，其肠道屏障功能损伤越重。这也与既往一些有关ASD与肠道屏障功能之间关系的研究的结果相似。例如，de Magistris等[16]通过口服果糖/甘露醇回收率实验发现，36.7%的孤独症患儿和21.2%的孤独症患儿父母肠道通透性增加，而对照组中发生肠道通透性改变的儿童仅占4.8%。另有动物实验显示，丙戊酸诱导的ASD大鼠模型存在黏膜肌层厚度变薄和肠动力下降的情况[17]。Hsiao等[9]研究发现，孕期感染病毒的母鼠，其子代除了表现出ASD的核心症状，在成年后还会出现肠道通透性增加，以及血液中肠道微生物代谢产物增加的情况。这些研究结果表明，ASD与肠屏障功能损伤相关，但是肠黏膜组织病理学、口服乳糖/甘露醇回收率试验等检测方法应用较少，不适宜推广，目前仍缺少认可度高、可方便快捷评估ASD患者肠道屏障功能的方法，而本研究结果提示血清D-乳酸或可发挥这一评估作用。

当前世界各国对ASD的研究基础仍很薄弱[18-19]，尤其对ASD的病因研究仍较缺乏。近年来，肠道微生物-肠-脑轴机制逐渐受到重视，肠道屏障功能可能是其中的关键一环，本研究表明ASD患儿的血清D-乳酸水平升高，这反映其肠道屏障功能存在一定损伤，且孤独症疾病评分越高，肠道屏障功能损伤越严重。由此可见，对肠道屏障功能进行及时和连续的监测可以评估ASD患儿肠-脑轴的变化，具有重要的临床价值。但本研究样本量不大，加上饮食差异等因素可能对肠道屏障功能产生潜在影响[6，20]，因此未来仍需更加深入地研究以明确肠道屏障功能在ASD中的作用。