TPM4对人胰腺癌细胞侵袭和迁移的影响

刘松柏，刘鹏，王兴，朱昌毫，费晓斌，蔡浚哲，潘耀振

（1.贵州医科大学 临床医学院，贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学附属肿瘤医院 肝胆外科，贵州 贵阳 550008）

胰腺癌是最致命的恶性肿瘤之一[1]，其恶性程度高、进展快、早期诊断困难且预后极差，被列为全球癌症相关死亡的主要原因之一[2-3]。其近期5年总生存率仅为7.7%，中位生存期约为6 个月[4]，它是美国癌症相关死亡的第四大原因，也是全球第七大恶性肿瘤死亡原因[5]。由于胰腺癌早期无特异性临床症状，绝大多数患者在发现时已中晚期。因此，迫切寻找胰腺癌早期诊断和治疗的生物标记物具有重大意义。原肌球蛋白（TPM）是一种早期被发现的蛋白质，以丝状肌动蛋白结合蛋白的形式存在于各种动物的细胞骨架和肌肉细丝中[6]。原肌球蛋白4（TPM4）是原肌球蛋白家族中肌动蛋白结合蛋白家族的一员，提供肌动蛋白细丝的结构稳定性，并调节细胞骨架功能[7]。此外，肌动蛋白-TPM4 微丝对收缩、细胞形态、细胞运动和细胞内小泡运输都很重要[8]。目前越来越多的报道表明，TPM4参与了肿瘤的发展[9]，但TPM4 在胰腺癌中的作用尚不清楚。本研究通过对TPM4 过表达或敲低，研究其对人胰腺癌细胞侵袭迁移的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料

人胰腺癌细胞株：ASPC-1、BxPC-3、MIA PaCa-2、PANC-1、SW1990、HPDE均购自美国ATCC细胞库；DMEM高糖培养基、RPIM1640、10%胎牛血清、0.25%胰蛋白酶等购自美国Gibco公司；小干扰RNA购自于中国广州锐博生物科技有限公司，过表达慢病毒购自中国上海吉凯基因公司；Lip3000购于美国invitrogen；TPM4抗体购于中国武汉三鹰公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析：通过TCGA、GEPIA等数据库分析TPM4 在胰腺癌中的表达情况及与患者生存预后之间的关系。

1.2.2 细胞培养：所有细胞均在含10%胎牛血清的DMEM或RPIM1640，37 ℃，5% CO2培养箱中培养，提取对数期生长细胞进行后续实验。

1.2.3 细胞转染：取对数期生长细胞MIA PaCa-2、PANC-1，接种2×105个细胞于六孔板中，待细胞密度达到30%～40%时以Lip3000 脂质体为介质进行siRNA转染，先使用无血清培养基分别孵育Lip3000及siRNA各5 min，随后将二者混合孵育15 min后缓慢滴入细胞中，摇匀，培养箱中培养6 h后更换新鲜培养基，24～48 h提取RNA，验证转染效率，48～72 h提取细胞蛋白，进行Western blotting实验验证转染效率。

1.2.4 细胞慢病毒感染：取对数期生长细胞MIA PaCa-2、PANC-1，接种1×105个细胞于培养瓶中，培养12 h后进行病毒感染，根据病毒MOI值将病毒体积吸入培养瓶中，摇匀，放入培养箱中培养，24 h后进行细胞换液，取对数期细胞进行后续实验。

1.2.5 qRT-PCR检测TPM4 mRNA表达水平：收集待测细胞，加入1 mL Trizol试剂，提取总RNA。然后使用PrimeScriptTMRT Reagent试剂盒（日本TaKaRa）逆转录RNA。qRT-PCR分析使用TB Green®Premix Ex TaqTM（日本TaKaRa）。选择GAPDH作为内源性参照物，实验结果的分析采用2-ΔΔCt方法计算，所有步骤均按说明书严格执行。

1.2.6 Western blotting检测TPM4蛋白表达水平：收集待测细胞并加入200 μL裂解液（RIPA∶广谱蛋白酶抑制剂∶磷酸化酶抑制剂∶PMSF=100∶2∶2∶1）。收集蛋白上清液，加入5×loading buffer（蛋白上清液：5×loading buffer=4∶1），95 ℃煮沸10 min。然后将各组细胞蛋白进行电泳分离，将凝胶中电泳分离的蛋白转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，TBST洗膜3 次后放入1∶1 000 稀释的TPM4 抗体于4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次后加入二抗继续于室温孵育2 h，TBST洗膜3次后在化学发光仪中进行观察。

1.2.7 划痕实验检测胰腺癌细胞迁移能力：取siRNA干扰或过表达MIA PaCa-2、PANC-1细胞消化离心并接种于六孔板中，待细胞长满整个孔径时，将直尺置于孔径上方，移液枪进行划痕，PBS洗涤2次后于显微镜下进行拍照，并放置培养箱48 h后再次进行拍照，最后对各组细胞相对迁移距离进行比较。

1.2.8 Transwell实验检测胰腺癌细胞侵袭、迁移能力：取siRNA干扰或过表达MIA PaCa-2、PANC-1细胞消化离心并调整密度为2×105个/mL，取200 μL细胞悬液接种于含或不含基质胶（Matrigel胶∶无血清DMEM培养基=1∶8）的上室内，下室加入600 μL含20%胎牛血清的DMEM培养基，放置培养箱中培养24～48 h，PBS清洗2遍，1 mL 4%多聚甲醛室温固定15 min，PBS清洗2遍，1 mL 0.3%结晶紫染色20 min，PBS清洗后烘干，最后显微镜下进行计数。

1.3 统计学分析

采用SPSS 25.0统计软件分析，计量资料两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TPM4在胰腺癌细胞中的表达

通过TCGA、GEPIA数据库中筛选成对样本进行数据分析，结果显示TPM4 基因在胰腺癌中高表达，且与胰腺癌患者总体生存率及无病生存率呈负相关（见图1A～C），进一步通过qRT-PCR对胰腺癌细胞系进行验证，结果表明：与HPDE相比，TPM4在胰腺癌细胞系中高表达，其中以MIA PaCa-2、PANC-1 细胞最为显著（见图1D），因此选择这两株细胞作为后续实验。

图1 TPM4在TCGA、GEPIA数据库及胰腺癌细胞系中高表达

2.2 TPM4转染后的表达水平

针对以上结果，我们将siRNA及过表达慢病毒转染MIA PaCa-2、PANC-1细胞，采用qRT-PCR进行验证，结果表明：与对照组si-NC相比，敲低组三条si-TPM4表达量均降低，其中以si-TPM4#2最为显著（图2A、B），因此选择si-TPM4#2作为后续研究。而与Control组相比，过表达组显著上调TPM4表达量（见图2C）。进一步通过Western blotting进行验证，结果表明：过表达组TPM4表达量明显高于Control组，敲低组TPM4表达量明显低于si-NC组（见图2D）。这些结果表明过表达及敲低组构建成功。

图2 TPM4 siRNA及稳转慢病毒效率验证

2.3 TPM4对胰腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响

为进一步研究TPM4 对胰腺癌细胞侵袭迁移能力的影响，我们首先采用伤口愈合实验，结果表明：与Control组相比，过表达组胰腺癌细胞迁移能力明显增强，而敲低组胰腺癌细胞迁移能力减弱（图3A）。接下来通过Transwell实验，结果表明：过表达组细胞侵袭迁移能力显著增强，而敲低组细胞侵袭迁移能力减弱（图3B）。这些结果都表明：过表达TPM4能促进胰腺癌细胞侵袭迁移。

图3 TPM4促进胰腺癌细胞侵袭和迁移（HE，×100）

3 讨论

与其他癌症不同，胰腺癌的发病率持续上升，存活率几乎没有改善，治疗中的主要挑战仍然是患者在确诊时已进展为疾病晚期[10]。目前，手术是胰腺癌唯一潜在的治愈方法，但由于局部和远期复发的高频率，单靠手术治疗的方法往往达不到预期临床结局[11]。原肌球蛋白（TPM）是一类肌动蛋白相关蛋白家族，它沿着肌动蛋白细丝的主要α螺旋沟槽形成卷曲二聚体[12]，与肌动蛋白、肌钙蛋白、原肌球蛋白等其他肌节蛋白一起在调节肌肉收缩中发挥重要作用[13]，在哺乳动物中，原肌球蛋白由4个不同的基因编码：TPM1、TPM2、TPM3和TPM4组成[14]。据报道，TPM4被认为是几种癌症的潜在标志物，如卵巢癌患者血清中TPM4 水平较对照组升高[15]，在肿瘤的发展中发挥重要作用。相关研究表明，TPM4在结肠癌组织和细胞系中的表达低于正常结肠组织和细胞系[16]，而TPM4在肝癌组织[17]、食道癌组织[18]中的表达高于正常组织。此外，TPM4参与调节细胞运动，通过调节F-肌动蛋白的形成促进肺癌细胞迁移[19]。敲低TPM4 能够抑制肺癌细胞增殖，促进肺癌细胞凋亡[20]。沉默TPM4 的表达能显著抑制胃癌细胞的体外侵袭、迁移能力[21]。

为进一步研究TPM4 是否参与调节胰腺癌细胞侵袭、迁移。我们首先通过生物信息对TCGA、GEPIA等数据库分析，发现TPM4基因在TCGA数据库共享的大量样本中癌组织的mRNA表达丰度显著高于癌旁组织，并与临床总生存率和无病生存率密切相关，提示TPM4 可能在胰腺癌中可能发挥致癌作用。其次，我们通过qRT-PCR对胰腺癌细胞系进行验证，发现TPM4 在胰腺癌细胞系中高表达，提示TPM4 有望成为胰腺癌潜在的生物学标志物。最后我们通过对TPM4进行过表达或敲低，研究TPM4对胰腺癌细胞侵袭迁移能力的影响，发现过表达TPM4促进胰腺癌细胞侵袭迁移，敲低TPM4 则减弱胰腺癌细胞侵袭迁移。

总之，我们通过初步研究TPM4 在胰腺癌细胞中的作用，发现TPM4 在胰腺癌细胞中高表达，TPM4 能够调节胰腺癌细胞侵袭迁移的能力，为胰腺癌早期临床诊断、预后等提供参考，但其具体调控机制尚不清楚，仍需进一步探索。