双盾木的快速繁殖技术研究

贾 越，樊思羽，汪铭溥，张李平，吉文丽

（西北农林科技大学，陕西 杨凌 712199）

双盾木（Dipeltafloripunda）属隶属忍冬科双盾木属，北温带植物区系中的古老、孑遗的木本属之一[1]。聚伞花序、花钟状粉红色，在陕西省宝鸡地区花期为4月初至4月中旬，花期约10 d；花后一对苞片增大呈盾牌状，十分奇特，是难得的园林观赏植物，1996年被宝鸡市植物园引种后其每年开花，但果实干瘪无种仁，播种繁殖无望[2]。

目前有关双盾木的文献中，除扦插、叶绿体基因组分析与遗传多样性的ISSR分析外，有关其再生繁殖方面的研究在国内尚属空白。通过实验，旨在探究双盾木快繁技术各个阶段所需最适培养基，以构建双盾木组织培养的繁殖技术体系为基础，为忍冬科双盾木属其他植物的快速繁殖技术提供案例与借鉴意义；同时还能为秦岭植物的引种驯化作出贡献，丰富陕西地区乡土植物景观；并且在总体上增加园林观赏植物种类的多样性，提升我国园林生态城市水平。

1 实验材料与条件

1.1 实验材料

1.1.1 实验试剂

MS粉、无水乙醇、NaClO、NAA、6-BA、2，4-D、无菌水、琼脂和蔗糖。

1.1.2 实验器材

电磁炉锅、高压蒸汽灭菌锅、玻璃瓶、玻璃棒、量筒、电子天平、超净工作台、镊子、解剖刀、电热灭菌器、培养架和日光灯。

1.1.3 植物材料

西北农林科技大学博览园内有3株从秦岭引种繁殖的双盾木植株，外植体材料均采集于此，主要选用幼嫩带芽茎段部位和叶片来进行组织培养。

1.2 实验条件

1.2.1 外植体采集条件

外植体采集时应选择晴朗无云的天气，上午9—11点或下午3—4点2个时间段为宜，可降低材料的污染率，提高诱导的成功率。

1.2.2 培养基的配置

（1）MS培养基的制作。在实验过程中，诱导双盾木愈伤组织产生的培养基采用：MS粉（4.43 g/L）+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂，按照所需配量加入激素原液。

（2）植物生长调节剂的配置。6-BA原液：1 mg/mL（需加入少量NaOH将其溶解，再用无菌水进行定容）；NAA原液：1 mg/mL（需加入少量盐酸将其溶解，再用无菌水进行定容）；2，4-D原液：1 mg/mL。

（3）培养基的配置。选用MS作为基础培养基，在此基础上，加入激素6-BA、NAA及2，4-D，并调节pH在5.8~6.0，完成后分装至培养瓶即可。

2 实验方法及参数选择

2.1 初代培养

2.1.1 嫩芽的处理与培养

（1）处理方法。采取的嫩芽用软毛刷轻轻刷去表面灰尘，清水冲洗干净之后用无菌水冲洗3~5遍。

（2）消毒。在无菌室内的超净工作台上，将处理过的嫩芽先用75%酒精浸泡1 min，后以无菌水冲洗2~3遍；接着用10%的NaClO浸泡10~25 min，再用无菌水冲洗2~3遍，最后用无菌滤纸吸干表面水分。剥去一层外皮后接种于诱导培养基上。

为了确定最佳消毒时间，实验按照15、20、25 min 3个时间梯度进行消毒，每个梯度接种10瓶，每瓶接种1个外植体，共计30瓶。培养基添加MS粉（4.43 g/L），琼脂（7 g/L），蔗糖（3 g/L），NAA，6-BA，pH 5.8~6.0。

（3）激素含量梯度实验。针对最适诱导的激素梯度进行实验。选用NAA和6-BA作为实验激素，NAA分为0.05、0.1、0.2 mg/L这3个梯度，6-BA分为0.5、1.0 mg/L这2个梯度，对其进行交叉实验，每组接种15瓶，每瓶接种3个外植体。

2.1.2 叶片的处理与培养

（1）处理方法。采取的叶片先用软毛刷轻轻刷去表面灰尘，用清水冲洗干净，重点清洗叶脉及叶片基部，最后用无菌水冲洗3~5遍。

（2）消毒方法。将叶片切成4 mm×4 mm左右的小块，用75%酒精浸泡1 min后用无菌水冲洗2~3遍，接着用不同含量的NaClO溶液浸泡10~25 min，再用无菌水冲洗2~3遍，最后用无菌滤纸吸干表面水分，接种于诱导培养基上。

为了确定含量和时间，我们将NaClO含量分为10%、15%、18%、20%4个梯度，将消毒时间分为10、15、20、25 min 4个消毒时间梯度，每个梯度接种10瓶，每瓶接种2~3个叶片，共计120瓶。培养基添加MS粉（4.43 g/L）、琼脂（7 g/L）、蔗糖（3 g/L）、2，4-D、6-BA并将pH调节至5.8~6.0。

（3）激素选择。愈伤组织的分化与再生是植物实现由细胞到植株的过程。查阅双盾木同科植物组织培养文献后，选定激素6-BA和2，4-D进行诱导实验。

2.2 继代培养

在初代培养的基础上，获得的愈伤组织数量有限，不能充分发挥组织培养快速繁殖的优势，所以需要根据初代培养中影响双盾木培养的主要因素，合理选择继代培养基组合，以获得大量增殖的材料。

实验选定6-BA和NAA作为调控愈伤组织增殖的生长类激素，给6-BA设置1.0、1.5、2.0mg/L3个梯度；同时给NAA设置0.2、0.4 mg/L共2个梯度。

3 讨论与结论

3.1 消毒方法

根据上述实验中不同的消毒时间、NaCIO含量等参数选择得出表1和表2数据。

表1 不同消毒时间嫩芽接种效果（污染率）比较

表2 愈伤形成情况

而不同叶片消毒时间和NaClO含量的对应关系见表3。

表3 不同消毒时间、NaClO含量叶片接种效果（污染率）比较

由此得出结论：双盾木嫩芽最佳灭菌方式为75%酒精处理60 s后用无菌水冲洗3~5遍，接着用10% Na－ClO溶液处理15 min，剥去外叶片接入培养基，平均污染率最低可控制到2%；嫩叶最佳灭菌方式为75%酒精处理60 s后用无菌水冲洗3~5遍，接着用20%NaClO溶液处理15 min。

3.2 初代培养

根据不同的激素含量可得到表4中对应的实验数据，可以看到：当NAA为0.2 mg/L、6-BA为1.0mg/L时，愈伤组织诱导率最高。

表4 嫩芽初代培养实验结果

由此得出结论：嫩芽最适培养基配方组合为MS+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA，愈伤组织诱导率达86%。

3.3 继代培养

按照2.2小节中不同梯度参数进行交叉实验，可得到表5中继代增殖培养实验数据。

表5 继代增殖培养实验结果

由此得出结论：愈伤组织适宜的继代培养基组合为MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，增殖倍数达到1.292，且生长率较高，达到44.4%。其他几组培养基虽也有增殖效果，但是增殖倍数均小于1.292，无不定芽发生。

4 建议与展望

在植物组织培养技术被广泛运用的今天，作者认为通过组织培养技术实现双盾木的大量繁殖存在广阔的进步空间，以及深入研究和推广的价值。结合实验，作者对双盾木组织培养的研究提出以下几点建议，希望这项研究在今后可以取得突破性进展。

（1）选取外植体时，以幼嫩植物器官为主，越幼嫩的植物器官细胞活性越强，实验也越容易成功[3]。同样是4 mm×4 mm的叶片，刚生长出的嫩叶比半成熟叶片的出愈率高，未展叶嫩芽出愈率高于展叶嫩芽。

（2）合理确定消毒时间。一般的原则是茎大于叶大于芽，成熟器官大于幼嫩器官[4]。实验中，嫩叶与嫩芽消毒时间一致的情况下，嫩叶所需消毒溶液含量是嫩芽的2倍。

（3）外植体消毒过后再进行实验时，应剥掉最外层表皮；选用嫩芽做外植体时，在接种过程中要剥除最外层包被叶片。

（4）在培养出愈伤组织后，可以直接进行生根培养，免去生成不定芽的步骤，缩短试验周期[5]。推荐使用当年生枝，更容易生成愈伤组织；若遇到双盾木休眠期，可以从休眠植株上剪下有芽新枝在温室进行水培。