戊二醛-聚乙烯醇表面共聚硅胶强极性固定相的制备与评价

钱 堃，杨丙成

(1.华东理工大学 药学院，上海 200237；2.上海市医药学校，上海 200135)

亲水作用色谱(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)是目前分离极性化合物最常用的色谱技术之一[1-2]。它采用强极性固定相、高比例有机相低比例水相的流动相实现了对极性化合物的有效分离分析。这克服了极性化合物在反相色谱柱上保留弱、在正相色谱柱上溶解度差的缺陷，且与质谱等质量型检测器有很高的兼容性。因此，HILIC常被应用于蛋白质组学、代谢组学和药物分析等诸多领域。不同于反相色谱保留机理相对单一的特点，HILIC保留机理比较复杂，其分离选择性改变主要借助于不同官能团的色谱柱来实现，而流动相组成相对单一。因此发展不同选择性的固定相一直是该领域活跃的研究方向[3-4]。

硅胶由于刚性好、易于改性等优势而广泛应用于液相色谱包括HILIC固定相的制备[5-6]。目前绝大多数HILIC固定相使用硅胶基质。但在HILIC模式下，硅胶型固定相常存在明显的柱流失。柱流失是指固定相在流动相中水解而造成基质表面键合官能团或基质分子脱落进入流动相中的现象。流失的组分通过质量型检测器(如质谱、蒸发光检测器、电喷雾检测器)时就会造成基线噪声和漂移的增加，这在梯度洗脱时尤为明显[7]。柱流失现象在其他液相色谱模式中不太明显，但在HILIC中非常显著(这是其保留机理所造成的)。它甚至被称为HILIC的阿喀琉斯之踵[8]。

为改善极性固定相的柱流失，已出现了很多方法，包括使用较大空间位阻的连接臂[9]、惰性介质[10]、纳米颗粒屏蔽[11]等。Armstrong等采用环果聚糖为连接臂，结合多点连接技术报道了一种高柱效、高稳定性的极性固定相[9]。Liu 和Pohl 采用季胺型纳米乳液涂覆在硅胶表面制备出混合型固定相[11]。作者课题组前期报道了使用聚乙烯醇(polyvinyl alcohol， PVA)涂覆苯基改性硅胶，可显著降低柱流失。需要指出的是，该方法虽然在一定程度上提高了固定相的抗水解性能，但其柱流失仍然不太理想[12]。本文在前期基础上，尝试在PVA溶液加入戊二醛(glutaraldehyde，GA)交联剂，通过PVA上的羟基与GA发生羟醛缩合反应，增强PVA膜对硅胶的保护作用，从而改善固定相抗流失性能。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：磁力搅拌器购于IKA设备有限公司(德国)；SHZ-D(Ⅲ)型循环水泵，上海予英仪器有限公司(中国)；PH-070A型干培两用箱，上海一恒科学仪器有限公司(中国)；SB-5200 DTDN型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司(宁波，中国)；Waters 2695型液相色谱仪(沃特世，美国)，包括自动进样器和柱温箱，2998型紫外可见光检测器、EmpowerTMPro 2汉化版色谱工作站；赛默飞高效液相色谱仪Vanquish Flex配置电喷雾检测器(charged aerosol detector， CAD)(美国)；装柱机，大连思谱精工有限公司(中国)；实验用水来自Milli-Q纯水系统。

试剂：单分散乙烯基硅胶(Vinyl-Sil)(粒径5 μm，孔径10 nm，比表面积300 m2/g)购于华谱科技有限公司(浙江，中国)；盐酸、无水甲苯、吡啶、PVA(1750±50)、25% GA水溶液购自上海凌峰化学试剂有限公司(上海，中国)；苄硫醇(98%)、核苷、二羟丙茶碱(99%)购于J&K百灵威科技有限公司(北京，中国)；HPLC乙腈(99.9%)、甲醇(99.8%)购自Tedia公司(Ohio，USA)；其它样品均购自阿拉丁试剂上海有限公司(中国)。

1.2 固定相的制备

苯基改性硅胶制备方法参照以前方法[12]，其步骤简述如下：称取5 g乙烯基硅胶(Vinyl-Sil)超声均匀分散在45 mL甲醇中，依次加入5 mL苄硫醇、50 mg AIBN，于N2保护下，65 ℃、250 r/min条件下加热反应24 h。反应后用5#砂芯漏斗过滤后用二氯甲烷、甲醇、水依次冲洗，于60 ℃过夜干燥即得苯基改性硅胶(Bte-Sil)。

极性固定相的制备：称取5 g PVA溶解在去离子水中，于500 r/min 100 ℃下加热搅拌1 h即制得5% (w/v)的PVA澄清水溶液，控制其温度在60 ℃待用；将上述反应中制备得到的Bte-Sil分散于甲醇中，抽滤后快速加入上述PVA水溶液中，接着加入0.5%戊二醛水溶液，超声5 min使溶液均匀分散，再在60 ℃ 下加热搅拌30 min，用5#砂芯漏斗减压抽滤，抽滤至滤饼状，并于140 ℃热聚合1 h，后续轻微研磨、超声分散即得到最终的极性固定相(PVA@GA-Bte-Sil)。固定相的制备路线如图1所示：

图1 极性固定相合成路线

1.3 色谱柱装填

称取上述极性固定相(2 g)，超声分散于甲醇(20 mL)中，以甲醇作为顶替液恒压(5 000 psi)装柱30 min、泄压30 min、使用甲醇在0.2 mL/min的流速冲洗过夜。

为便于对比，选取5根商品化HILIC色谱柱，包括裸硅胶、XIon、XAmide(华谱新创、浙江，中国)、Acclaim-10、Syncronis Amino(Thermofisher Corp.)，以及之前制作的PVA涂覆苯基改性硅胶色谱柱(PVA-Bte-Sil)[12]进行了平行比对；7种色谱柱规格均为4.6 mm× 150 mm，粒径均为5 μm(除Acclaim-10使用3 μm)。

2 结果与讨论

2.1 固定相结构表征

对得到的固定相进行了元素分析表征。相比于Bte-Sil的含碳量7.08%，通过PVA与GA交联涂覆后得到的固定相PVA@GA-Bte-Sil的含碳量有明显增加(12.44%)；固定相的红外光谱表征结果如图2所示，相较于Bte-Sil，PVA@GA-Bte-Sil光谱在2 947 cm-1有明显的饱和C-H伸缩振动，进一步证明GA@PVA涂敷在Bte-Sil表面。

图2 不同固定相红外光谱

2.2 色谱性能评价

首先评估了PVA@GA-Bte-Sil在HILIC模式下分离极性化合物的性能。采用7种核苷作为测试样品，并与3种商品化HILIC柱进行比较。如图3(a)所示，PVA@GA-Bte-Sil对模型样品均达到了基线分离，且表现出较高的柱效(比如对胞嘧啶的理论塔板数可达60 000/m)。与商品化色谱柱相比，保留时间略短，这可能是内层苯环存在导致其还有一定的疏水性；另外，以小分子有机碱为模型样品，将PVA@GA-Bte-Sil与之前报道的PVA-Bte-Sil(即无GA交联的极性固定相)进行了分离对比。由图3(b)可以看出，两种固定相在保留时间、分离选择性上几乎完全相同。说明PVA@GA-Bte-Sil并没有因为GA的引入而对固定相的亲水性造成明显影响。

图3 PVA@GA-Bte-Sil分离核苷(a)和有机碱(b)条件：流动相：90%乙腈-10%甲酸铵溶液(200 mmol/L，pH 6.8)；流速：1 mL/min；柱温35 ℃；检测波长：254 nm；峰识别：1、尿嘧啶，2、5-甲基尿苷，3、尿苷，4、腺苷，5、腺嘌呤，6、胞嘧啶，7、胞苷；8、4-乙基苯胺，9、咖啡因，10、二羟丙茶碱，11、盐酸小檗碱，样品浓度：50～200 mg/L；进样量：2 μL

以7种核苷评估了PVA@GA-Bte-Sil的日内和日间稳定性。其日内保留时间相对标准偏差(relative standard diviation，RSD)为0.08%～0.17%，峰面积RSD为0.14%～0.50%(n=9)，显示PVA@GA-Bte-Sil良好的重复性；另外，以4种水溶性维生素(对氨基苯甲酸、维生素B2、维生素B13、维生素B3)评价了其日间重复性：连续3天，每天进样9次，共计27次(见图4)。其保留时间RSD≤0.18%，峰面积RSD≤0.92%，进一步表明PVA@GA-Bte-Sil良好的日间重复性。

图4 PVA@GA-Bte-Sil日间重复性(条件同图3)

另外，选择3种不同电荷状态的样品——尿嘧啶(中性)、烟酸(阴离子)和苄基三甲基氯化铵(Benzyl Trimethyl Ammonium Chloride，BTAC，阳离子)，采用相对于HILIC而言比较苛刻的流动相(75%乙腈-25% 60 mmol/L甲酸铵，pH 6.8)冲洗3 000倍柱体积考察了其稳定性(见如图5)。在此过程中，三种样品的保留时间和峰面积RSD均分别低于1.02%和1.54%。

选取5种核苷样品作为标样，保持流动相中的缓冲盐浓度不变，改变流动相中水含量考察了PVA@GA-Bte-Sil保留机理。结合文献报道的HILIC保留机理拟合方程lnk=a+b× lnφ+c×φ求得的相关系数均不低于0.998 1，表明其保留符合典型HLIC机理。

2.3 柱流失测试

为考察PVA@GA-Bte-Sil抗流失性能，采用CAD实时检测柱流出物的信号大小来评估流失大小。图6是几种色谱柱的在梯度洗脱模式下的柱流出物检测结果(以PEEK管作为空白对照，抗流失性能较好的商品化柱Acclaim HILIC-10作为参照基准)。在10%和50%水相流动相条件下，PVA@GA-Bte-Sil都表现出了最低的低流失；以3～5 min内10%水相和10～11 min内50%水相测量色谱柱的背景信号和基线噪声，结果见表1。在含高比例水相条件下，PVA@GA-Bte-Sil背景信号仅为1.46 pA，相当于Syncronis Amino(52.16 pA)的0.03倍，也远低于Acclaim HILIC-10色谱柱和PVA-Bte-Sil。可以看出，通过PVA和GA共聚达到了改善柱流失的设计效果。

表1 柱流失检测(基线背景与噪声)

图6 PVA@GA-Bte-Sil色谱柱与其他色谱柱柱流失对比

为了突出PVA@GA-Bte-Sil低柱流失的效果，选择5种非还原性糖为分析对象，对比了其在PVA@GA-Bte-Sil和商品化XAmino的分离(见图7)。在相同条件下，PVA@GA-Bte-Sil相对于XAmino不仅基线背景下降了约11倍，基线噪声也有约9倍的下降，而且样品信号也有明显的增强，以D-核糖为例，其峰高从28.09 pA(XAmino)增加到131.22 pA(PVA@GA-Bte-Sil)。总的结果就是系统信噪比的显著提升。

3 结论

通过在苯基改性硅胶表面引入GA和PVA共聚涂层制备出类核壳型极性固定相。所得固定相对常见极性化合物表现出良好的分离效果，其保留机理符合典型的HILIC机制，具有良好的抗流失性能和高的运行稳定性。该方法将为制备包括硅胶在内的其他基质极性固定相提供了一种新方法。