HPLC-MS法检测盐酸美金刚片中N-（二甲基金刚烷）甘氨酸的含量

黄引，蔡国伟，钟莹，肖颖，秦飞，赖烨才*，林顺权（1.广州白云山医药集团股份有限公司白云山制药总厂，广州 510515；2.广东省化学药原料与制剂关键技术研究企业重点实验室，广州 510515；.广州牌牌生物科技有限公司，广州 51050）

盐酸美金刚（memantine hydrochloride），化学名为1-氨基-3，5-二甲基金刚烷盐酸盐，是一类新的通过阻断

N

-甲基-

D

-天门冬氨酸（NMDA）受体作用于谷氨酸能系统从而治疗阿尔茨海默病的药物。盐酸美金刚可抑制兴奋性神经传递递质谷氨酸的过度释放，减轻钙离子过多所致的神经元细胞中毒、损伤和死亡，从而改善阿尔茨海默病患者的症状，具有耐受性良好、用药安全的特点。随着仿制药一致性评价工作的开展，国内对药品杂质研究的重视程度越来越高，对于杂质控制与评价的先进理念、关键技术的需求也越来越大，药品储存过程中降解杂质会随着储存时间的延长而增加，有效控制降解杂质是亟需解决的问题。盐酸美金刚片在长期储存过程中，与辅料微晶纤维素会发生美拉德反应，产生降解杂质

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸，化学名为（3，5-二甲基-1-金刚烷）氨基乙酸，分子式为CHNO，化学结构见图1。制剂中辅料硬脂酸镁的存在，会使pH 升高从而促进美拉德反应，使

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸的含量增高。同时，在本文中影响因素试验碱性破坏条件下，

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸含量明显增高，进一步证明碱性条件对美拉德反应有促进作用。

图1 N-（二甲基金刚烷）甘氨酸的化学结构式Fig 1 Chemical formula of N-（dimethyl-monosane）glycine

为了更好地控制药品质量，保证用药安全，建立快速有效的检测方法对杂质

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸进行严格控制至关重要。盐酸美金刚及其相关杂质的结构式和紫外吸收全波长扫描光谱图均显示无特征吸收和末端吸收，因此无法采用紫外-可见光检测器对杂质进行定量；另外，TLC法存在分离能力差、重现性差、灵敏度低等缺点，目前盐酸美金刚含量测定及杂质的定量检测多采用气相色谱（GC）法。前期研究发现，GC 法对于降解杂质

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸并不适用，推测此杂质在GC 中容易发生高温降解而影响检测。进口注册标准中以0.1%三氟乙酸水溶液作为流动相，梯度洗脱30 min，单离子模式（SIM）同时对美金刚乳糖加合物和

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸进行检测。因本文研究的盐酸美金刚片工艺中未涉及乳糖的使用，无需对美金刚乳糖加合物进行研究控制；同时为减少长期使用三氟乙酸对质谱仪造成的损伤，拟采用甲酸水溶液替换三氟乙酸水溶液并在质谱多反应监测模式（MRM）下等度洗脱（运行时间10 min），对目标杂质

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸进行快速、准确的定量控制。最低本文建立了一种高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）分析方法对盐酸美金刚片中

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸进行定量检测，并对方法进行了验证，现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent1260-AB Sciex 4000 液相色谱-质谱联用仪（美国Agilent 公司）；Sartorius CPA 225D 型分析天平（德国Sartorius 公司）；Merck Millipore Milli-Q 实验室超纯水系统（德国Merck Millipore公司）。

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸对照品（TRC，批号：6-NSR-122-1，含量：98%）；盐酸美金刚片（广州医药集团股份有限公司白云山制药总厂，批号：01171202、01171203、01171204，规格：10 mg）；甲醇、甲酸（美国Merck 公司，色谱纯）；水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 液相色谱与质谱条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱Phenomenex Luna C（150 mm×4.6 mm，5 μm）；以0.1%（

V

/

V

）甲酸水溶液-甲醇（30∶70）为流动相，等度洗脱；流速：0.5 mL·min；柱温：30℃；进样量：10 μL，运行时间：10 min。2.1.2 质谱条件 采用三重四极杆质谱检测器，电喷雾离子源（ESI）；电喷雾电压为3500 V；离子源温度为500℃；以高纯氮气为干燥气；二级碰撞能（CE）为2 V；正离子模式下选择质荷比为（

m

/

z

）238.1/163.3 的离子对进行定性定量检测，质谱图见图2，裂解途径见图3。

图2 全扫描质谱图（A）和离子对提取质谱图（B）Fig 2 Full scan mass spectrogram（A）and ion-pair extraction mass spectrogram（B）

图3 N-（二甲基金刚烷）甘氨酸的裂解途径Fig 3 Fragmentation pathway of N-（dimethyl-monosane）glycine

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液 取

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸对照品适量，精密称定，用甲醇-水（50∶50）溶解并定量稀释制成1 μg·mL的对照品储备液。精密量取对照品储备液适量，用甲醇-水（50∶50）分别稀释制成质量浓度为0.01、0.03、0.10、0.20、0.30、0.50、0.70 和1.00 μg·mL的标准曲线系列对照品溶液。2.2.2 系统适用性溶液 称取适量的

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸对照品，用甲醇-水（50∶50）溶解并定量稀释成1 μg·mL的溶液，作为系统适用性溶液。

2.2.3 供试品溶液 取本品1 片，置100 mL 量瓶中，用甲醇-水（50∶50）溶解并定量稀释制成0.1 mg·mL的溶液，作为供试品溶液。

2.2.4 破坏试验用溶液

① 空白辅料：取空白辅料适量，精密称定，置100 mL 量瓶中，用甲醇-水（50∶50）溶解并定量稀释至刻度，作为空白辅料溶液。

② 酸破坏：取本品1 片，置100 mL 量瓶中，用适量甲醇-水（50∶50）溶解，加入0.1 mol·L盐酸溶液1 mL，于80 ℃水浴加热2 h，用0.1 mol·L氢氧化钠溶液中和，用甲醇-水（50∶50）稀释至刻度，作为酸破坏供试品溶液。

③ 碱破坏：取本品1 片，置100 mL 量瓶中，用适量甲醇-水（50∶50）溶解，加入0.1 mol·L氢氧化钠溶液1 mL，于80 ℃水浴加热2 h，用0.1 mol·L盐酸溶液中和，用甲醇-水（50∶50）稀释至刻度，作为碱破坏供试品溶液。

④ 高温破坏：取本品1 片，置100 mL 量瓶中，用适量甲醇-水（50∶50）溶解，置80℃水浴中加热2 h 后冷却至室温，用甲醇-水（50∶50）稀释至刻度，作为高温破坏供试品溶液。

⑤ 氧化破坏：取本品1 片，置100 mL 量瓶中，用适量甲醇-水（50∶50）溶解，加入30%过氧化氢溶液1 mL，置80 ℃水浴中加热2 h 后冷却至室温，用甲醇-水（50∶50）稀释至刻度，作为氧化破坏供试品溶液。

⑥ 光照破坏：取本品1 片，置蒸发皿内，用适量甲醇-水（50∶50）溶解，于254 nm 紫外波长下照射2 h 后，将溶液移至100 mL 量瓶中，用甲醇-水（50∶50）稀释至刻度，作为光照破坏供试品溶液。

2.3 系统适用性要求

取系统适用性溶液连续进样6 次，

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸峰面积的

RSD

不得大于10.0%，保留时间的

RSD

不得大于2.0%。

2.4 测定法

本文所有色谱图均由Analyst 软件1.6.3 版本采集积分产生。标准曲线由MultiQuant 3.0.2 软件采用二次回归拟合方程

y

＝a

x

＋b

x

＋c 绘制，其中

y

为对照品溶液中

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸的峰面积，

x

为

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸的质量浓度，相关系数

r

应不小于0.998。在结果解析方程中，取系列对照品溶液质量浓度范围内，质量浓度与峰面积成正相关的值作为

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸的质量浓度，计算出其相对于盐酸美金刚的含量。

2.5 系统适用性

取系统适用性溶液连续进样6 次，记录

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸的峰面积和保留时间，并计算相应

RSD

值，结果

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸峰面积

RSD

为2.3%，保留时间

RSD

为0.1%，表明系统适用性良好。

2.6 专属性试验

按照“2.1”项下色谱条件，分别测定“2.2.4”项下的酸、碱、高温、氧化及光照破坏条件下的各供试品溶液，结果空白溶液及空白辅料对检测无干扰，

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸峰面积在碱破坏的条件下有明显增加，在酸、高温、氧化和光照破坏条件下无明显增加，并且已破坏样品溶液经本检测方法检测均只显

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸峰，表明盐酸美金刚片经酸、碱、高温、氧化和光照破坏后，均无其他杂质干扰，方法专属性强，见图4。

图4 专属性试验色谱图Fig 4 Chromatograms of specificity test

2.7 线性关系考察

按照“2.2.1”项下方法配制一系列线性溶液，取各线性溶液10 μL 进样，记录峰面积。结果显示

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸的拟合方程为

y

＝ －0.5200

x

＋6993

x

－2626，

r

＝0.9998，其在0.0102 ～0.102 00 μg·mL与峰面积呈现出良好的线性关系。

2.8 检测限与定量限

精密称取

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸对照品适量，用甲醇-水（50∶50）溶解并定量稀释制成一定浓度的样品溶液，按“2.1”项下条件测定。信噪比（

S

/

N

）约为3 作为检测限，

S

/

N

约为10 作为定量限，结果

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸的检测限为3.2 pg，定量限为14.7 pg。

2.9 加样回收试验

将盐酸美金刚片剂1 片置于100 mL 量瓶中，用甲醇-水（50∶50）适量溶解，再精密加入

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸对照品溶液（102 μg·mL）250 μL，用甲醇-水（50∶50）稀释至刻度，摇匀，作为50%限度测试溶液。同法配制100%和150%限度测试溶液。每个浓度配制3 份，分别按“2.1”项下条件测定，计算回收率。结果显示，

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸的加样回收率在92.5%～105.7%，

RSD

＜6.5%，符合方法学要求，见表1。

表1 加样回收率结果
Tab 1 Recovery of standard addition

限度测试溶液加入量/（μg·mL－1）实测量/（μg·mL－1）回收率/%平均回收率/%RSD/%50%0.2550.2925102.0103.81.8 0.2550.3020105.7 0.2550.2971103.8 100%0.5100.5377 99.1 99.03.9 0.5100.5172 95.1 0.5100.5564102.8 150%0.7650.8158102.4 99.7 6.3 0.7650.8297104.2 0.7650.7403 92.5

2.10 重复性

取同一批样品，按“2.2.3”项下方法配制6份供试品溶液，测定其中

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸的含量，结果

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸的含量

RSD

为2.9%，保留时间

RSD

为0.30%，表明方法重复性好。

2.11 耐用性

通过改变流动相流速、柱温来评估测定条件有微小变动时，对测定结果的影响，结果在各个色谱条件参数下，测得的6 份待测样品中

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸含量

RSD

均≤10.0%，符合要求，见表2。

表2 耐用性结果
Tab 2 Durability test

系统适用性峰面积RSD（n ＝6）/%参数含量/%RSD/%保留时间RSD（n ＝6）/%标准曲线柱温/℃280.0278.22.50.20y ＝－0.0466x2 ＋6272x ＋4485，r ＝0.9998 300.0312.30.14y ＝－0.5200x2 ＋6993x－2626，r ＝0.9998 320.0271.00.24y ＝－0.2971x2 ＋6597x ＋2404，r ＝0.9997流速/（mL·min－1） 0.4860.0318.82.10.060y ＝－1.2271x2 ＋7535x－3015，r ＝0.9999 0.5000.0322.30.14y ＝－0.5200x2 ＋6993x－2626，r ＝0.9998 0.5150.0274.10.30y ＝0.0777x2 ＋5888x ＋3434，r ＝0.9998

2.12 样品检测结果

取盐酸美金刚片3 批0 d 样品和3 批30℃长期试验样品（36 个月），按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件测定，结果3 批0 d样品中

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸均未检出，3 批30℃长期试验样品中

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸含量均为0.2%，样品中

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸含量均符合限度要求（＜0.5%），结果见表3。

表3 -(二甲基金刚烷)甘氨酸的含量测定结果
Tab 3 Content of -(dimethyl-monosane) glycine

批号含量/%01171202（0 d）0 01171203（0 d）0 01171204（0 d）0 01171202（30℃，36 个月） 0.2 01171203（30℃，36 个月） 0.2 01171204（30℃，36 个月） 0.2

3 总结

降解杂质

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸在放置过程中会随着时间的延长而增加，目前针对此杂质定量研究的文献报道较少，仅有盐酸美金刚片的进口药品注册标准对此杂质进行了定量控制。本研究采用HPLC-MS 法对

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸进行定量检测，有效解决了因目标物紫外吸收弱而无法使用液相色谱法、因易发生高温降解而无法使用气相色谱法检测的难题。该方法可操作性强、灵敏度高、检测时间短，可应用于盐酸美金刚产品中

N

-（二甲基金刚烷）甘氨酸杂质的检测与控制。