基于甲状腺激素及脱碘酶探讨桑葚多酚类物质对壬基酚所致神经行为毒性的干预效应

李中意，柯倩华，刘焕，韩文娜，朱思俞，柳春红,

（1.华南农业大学食品学院，广东广州 510642；2.广东省食品质量安全重点实验室，广东广州 510642）

壬基酚（Nonylphenol，NP）是一种重要的工业原料，常被用于生产表面活性剂、杀虫剂、润湿剂和乳化剂等。国内对NP 的需求量巨大，是仅次于美国的第二大消费市场。研究显示，空气、水体和土壤中的NP 污染情况十分严重，工业、农业和生活污水是环境中NP 的主要来源，我国大多数河流均有较高水平的NP 检出。水体中的NP 污染不仅会降低鱼类的生育能力，造成鱼类脏器毒性和胚胎发育毒性，更重要的是会对以鱼类为食的人类造成威胁，对人体产生生殖、免疫、神经等方面的毒性。有研究发现NP 在体内具有模拟雌激素的作用，影响雌性SD 大鼠仔鼠早期神经行为的发育，降低仔鼠的空间学习记忆。相似地，有研究显示长期暴露于NP 会导致其蓄积在大鼠甲状腺和血清中，使甲状腺的组织形态及超微结构发生变化，并且会干扰甲状腺受体和雌激素受体的表达，从而影响大鼠的神经行为。

桑葚是一种营养价值较高的小浆果，在世界各地种植广泛，果实可作为水果和中药食用，叶子可以用于喂养桑蚕。桑葚中除了富含人体必需的多种氨基酸，维生素和矿物质，还含有多种活性成分，如花青素、白藜芦醇等。桑葚已经被证实具有抗氧化和保护神经系统的作用，改善大鼠的内分泌紊乱，影响焦虑行为等。桑葚中主要的多酚类物质花青素和白藜芦醇对神经退行性疾病有明显的改善效果，如花青素具有较强的抗氧化能力，能改善不溶性淀粉样蛋白所致的神经毒性，提高大鼠在Morris 水迷宫中的空间记忆能力；白藜芦醇能够通过影响细胞的自噬，提高对大脑中病理性蛋白的清除能力。目前有研究表明桑葚粗提液对NP 所致的神经毒性有一定的干预效果，但桑葚粗提液中主要是哪种成分以及通过哪种途径对NP 毒性发挥干预作用尚不明晰。

本研究用桑葚粗提液和桑葚多酚类物质（花青素、白藜芦醇、花青素和白藜芦醇联合）对NP 染毒大鼠进行干预，从大鼠体重、食物利用率和脏器系数评价桑葚多酚类物质对NP 一般毒性的干预作用。通过旷场实验（Open field test,OFT）和高架十字迷宫实验（Elevated plus maze,EPM）对大鼠的神经行为进行评价，从甲状腺激素通路和脱碘酶水平分析桑葚及其多酚类物质对NP 染毒大鼠的神经调节作用，研究结果有助于深入探讨NP 导致大鼠神经毒性的机制，并且对进一步挖掘桑葚及桑葚多酚类物质的健康效应以及研发具有抗外源化学物毒性的保健食品具有重要的参考意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜桑葚 国家桑树种植资源华南分圃（广州）；桑葚花青素（纯度≥95%）成都草源康生物科技有限公司；白藜芦醇（HPLC≥98%）上海源叶生物科技有限公司；壬基酚 上海阿拉丁试剂公司；大鼠脱碘酶（DIO1、DIO2、DIO3）ELISA 检测试剂盒、大鼠甲状腺素（FT3，FT4）ELISA 检测试剂盒、大鼠促甲状腺素（TSH）ELISA 检测试剂盒 上海江莱生物科技有限公司；SPF 级雄性SD 大鼠 70 只，体重70～90 g，4 周龄，动物和饲料购于广东省医学实验动物中心（SCXK（粤）2018-0002），实验动物合格证号：44007200078791，通过华南农业大学实验动物伦理委员会批准（编号：2020b031）。

旷场实验装置和高架十字迷宫装置 上海移数信息科技有限公司；Ethovision 8.0 型行为轨迹跟踪分析系统 荷兰Noldus 公司；高效液相色谱仪 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 制备桑葚粗提液 参考杨婕的方法制备桑葚粗提液（MCE），该方法主要提取具有相应活性作用的多酚类物质，又以其中的花青素和白藜芦醇为代表参与后续的干预实验。将新鲜桑葚冷冻干燥后粉碎过筛（60 目），称取500 g 粉末，按照料液比1:15加入乙醇（体积分数80%），超声辅助提取1.5 h。静置后取上清液，桑葚果渣按以上步骤重复提取，将提取液进行真空抽滤，得到的浓缩液用超纯水定容至500 mL，即为桑葚粗提液，4 ℃避光保存备用。

1.2.2 桑葚粗提液总多酚、总花青素和白藜芦醇含量的测定 a.福林-酚法测定桑葚粗提液总多酚含量。使用80%乙醇溶液配制1 mg/mL 的没食子酸标准溶液，然后用80%乙醇溶液将其稀释为400、350、300、250、200、150 和50 mg/mL 的标准溶液。分别取125 μL 各浓度标准溶液与福林酚溶液1:1 混合，避光静置90 min 后测定760 nm 处吸光值，以没食子酸浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。将桑葚粗提液稀释100 倍，按上述步骤绘制标曲计算总多酚含量。

b.pH 示差法测定桑葚粗提液中总花青素含量。首先配制pH1.0 的氯化钾和pH4.5 的乙酸钠缓冲液。将桑葚粗提液稀释100 倍后取2 份，每份2.5 mL，分别用pH1.0 的氯化钾和pH4.5 的乙酸钠缓冲液定容至25 mL，得到浓度相同的不同样品缓冲液。将样品缓冲液进行水浴平衡（氯化钾缓冲液：70 ℃，45 min；乙酸钠缓冲液：40 ℃，45 min），分别在520 和700 nm处检测吸光值，根据参考文献中公式计算花青素含量。

c.参考标准NY/T 2641-2014《植物源性食品中白藜芦醇和白藜芦醇苷的测定 高效液相色谱法》，测定桑葚粗提液中白藜芦醇的含量。

1.2.3 实验动物分组及处理 将70 只大鼠单笼饲养于屏障环境中，大鼠可自由饮食，室内温度为（22±0.5）℃，相对湿度为50%～60%，明/暗12 h 循环。适应性饲养一周后，通过随机区组设计分组，根据大鼠体重分为7 组：空白对照组（C 组），桑葚对照组（MC 组：MCE，以多酚含量计，120 mg/kg·bw），NP 染毒组（NP 组：NP，270 mg/kg·bw，溶剂为玉米油），桑葚干预组（M 组，NP+MCE），花青素干预组（A 组，NP+花青素，按桑葚粗提液中花青素含量计），白藜芦醇干预组（R 组，NP+白藜芦醇，按桑葚粗提液中白藜芦醇含量计），花青素和白藜芦醇联合干预组（AR 组，NP+花青素+白藜芦醇，按桑葚粗提液中花青素和白藜芦醇含量混合）。NP 溶于玉米油后按照4 mL/kg·bw 灌胃。干预组溶剂为生理盐水，另添加0.5%的羧甲基纤维素钠溶液辅助溶解，按照10 mL/kg·bw 灌胃。每天上午9:00 空白对照组和桑葚对照组灌胃玉米油，染毒组和干预组灌胃壬基酚（溶于玉米油）；1 h后，空白对照组和NP 染毒组灌胃生理盐水，桑葚对照组灌胃桑葚粗提液（溶于生理盐水），干预组分别灌胃MCE、花青素、白藜芦醇和花青素与白藜芦醇的混合液（溶于生理盐水）。各组大鼠每天具体灌胃设计见表1，连续灌胃28 d。

表1 大鼠每天灌胃设计表Table 1 Operation table of rats by intragastric administration every day

1.2.4 大鼠体重和食物利用率的测定 每4 d 为一个灌胃期，每个灌胃期结束当天的同一时间称量体重和饲料剩余量，记录数据，食物利用率=（体重增量/饲料消耗量）×100

1.2.5 大鼠脏器系数的测定 大鼠在断颈处死前称量其体重，处死后在冰上进行解剖，将大鼠肝脏、肾脏、睾丸和大脑完整的剥离后称重，脏器系数=（脏器重量/大鼠体重）×100

1.2.6 行为学测试 行为学装置在彻底清洁后进行实验，实验开始前1 h 将大鼠转移到行为学实验室让其适应环境，开始实验时，从大鼠背后轻柔地将其取出鼠笼，放入OFT 和EPM 行为学装置中，然后立即离开实验区域，并通过行为学装置配套软件自动记录大鼠在5 min 内产生的行为学数据（OFT：总路程，进入中心区域次数、时间和路程，直立次数、修饰次数；EPM：入臂总次数和总时间，进入开臂次数和时间），实验结束后将行为学装置中大鼠的排泄物清理干净，并用75%的乙醇消除气味再进行下一次实验。

1.2.7 甲状腺激素水平的测定 行为学实验结束后，对大鼠进行眼眶取血，采血后常温静置30 min，然后3000 r/min 离心15 min，得到的上清液即为血清，用相应的ELISA 试剂盒检测血清中的FT3、FT4 和TSH。

1.2.8 脱碘酶水平的测定 大鼠断颈处死后，在冰上解剖分离肝脏。切取同一部位的适量肝脏组织并称重记录，按1:9 的质量比例加入PBS 缓冲液，在冷冻研磨仪中重复研磨，得到的匀浆液在4 ℃，3000 r/min离心20 min，取上清液用相应的ELISA 试剂盒检测DIO1、DIO2 和DIO3。

1.3 数据处理

实验数据处理后以均值±标准差（mean±SD）表示，使用SPSS20.0 软件对数据进行统计学分析，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较组间差异。若方差齐则采用LSD 检验，若方差不齐则采用Games-Howell 检验。<0.05 表示差异显著，<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 桑葚粗提液多酚类物质含量

通过实验测定得到，桑葚粗提液中总多酚含量为24.21 mg/mL，花青素含量为14.08 mg/mL，白藜芦醇含量为129.67 mg/mL。

2.2 大鼠体重和食物利用率变化

由图1 可知，在28 d 的灌胃期间各组大鼠的平均体重均呈现上升的趋势，C 组平均体重增长速度最快，MC 组和R 组次之。但随着灌胃天数的增加，各组大鼠体重的增长速率逐渐减缓，其中NP 组在28 d灌胃期后期体重增长速度最慢。

图1 桑葚多酚类物质对NP 染毒大鼠体重增长的影响Fig.1 Effects of mulberry polyphenols on body weight gain of rats exposed to NP

由表2 可知，灌胃前各组间大鼠体重无显著性差异（>0.05）。经过28 d 的灌胃后，与C 组相比，各组大鼠体重和体重增量均显著或极显著低于C 组（<0.05 或<0.01）。与NP 染毒组相比，四个干预组除R 组体重显著增加（<0.05）、体重增量极显著提高（<0.01）外，M、A 和AR 组大鼠体重和体重增量均无显著性差异（>0.05）。

表2 各组大鼠体重变化Table 2 Changes of body weight of rats in each group

由表3 可知，在28 d 灌胃期间，各组大鼠的食物利用率均逐渐下降。在灌胃前期，各组大鼠食物利用率没有明显差异。与C 组相比，NP 组食物利用率从第4 个灌胃期开始出现极显著下降（<0.01）；M 组食物利用率从第3 个灌胃期开始显著下降（<0.05），但从第6 个灌胃期开始有所恢复，与C 组无显著性差异（>0.05）；A、R 和AR 组食物利用率仅在第4个灌胃期有显著降低（<0.05）。与NP 组相比，四个干预组食物利用率均从第6 个灌胃期开始显著或极显著上升（<0.05 或<0.01）。从总食物利用率来看，四个干预组与NP 染毒组相比只有M 组食物利用率有极显著提升（<0.01）。

表3 各组大鼠食物利用率的变化Table 3 Changes of food utilization rate of rats in each group

综上所述，连续28 d 的NP 暴露后，大鼠体重和食物利用率会明显降低，说明NP 会影响大鼠的正常生长发育。四个干预组对NP 导致的大鼠体重和食物利用率的下降都有恢复作用，白藜芦醇对体重变化的改善最明显，而桑葚粗提液可以更好地改善NP 导致的食物利用率降低。

2.3 大鼠脏器系数的变化

由图2 可知，与C 和MC 组相比，NP 组大鼠的肾脏系数和肝脏系数均有显著或极显著增加（<0.05或<0.01），说明NP 染毒后大鼠的肾脏和肝脏产生了形态学变化；与NP 组相比，四个干预组的肾脏系数都有降低但无显著性差异（>0.05），肝脏系数也都有下降，并且A 组的肝脏系数显著下降（<0.05），这可能是因为花青素能够调节促凋亡蛋白和促炎因子的表达，从而抑制肝脏细胞凋亡。就大脑系数而言，与C 组相比，除MC 组和R 组，其余4 组大鼠大脑系数均显著或极显著增加（<0.05 或<0.01），说明NP 染毒可能使大鼠大脑产生了形态学变化；与NP 组相比，M、R、AR 组大脑系数都有下降趋势，其中R 组下降最明显，但没有显著降低，说明桑葚粗提液、白藜芦醇和联合干预组对大脑系数的有干预效果但不是很明显。就睾丸系数而言，各组大鼠间没有显著性差异（>0.05）。

图2 桑葚多酚类物质对NP 染毒大鼠脏器系数的影响Fig.2 Effects of mulberry polyphenols on organ coefficient of rats exposed to NP

2.4 桑葚多酚类物质对NP 染毒后大鼠神经行为的影响

各组大鼠在28 d 灌胃期前后的OFT 结果如表4和表5 所示。由表4 可知，各组大鼠的OFT 行为指标均无显著性差异（>0.05）。由表5 可知，与C 组、MC 组相比，NP 组大鼠活动总距离极显著下降（<0.01）。NP 组大鼠进入中心区的次数和时间显著低于C 组（<0.05），且在中心区活动距离和直立次数显著低于MC 组（<0.05）。大鼠进入中心区次数和时间越少，焦虑程度越高，这说明NP 染毒造模成功。与NP 染毒组相比，四个干预组的大鼠活动总路程都显著增加（<0.05），M 组、R 组和AR 组大鼠进入中心区域次数显著或极显著增加（<0.05 或<0.01），R 组大鼠在中心区域活动时间显著上升（<0.05），M 组和AR 组大鼠在中心区域活动距离显著增加（<0.05），AR 组大鼠直立次数极显著增加（<0.01），这些结果说明M 组、R 组和AR 组对大鼠焦虑均有一定的干预效果，而A 组的干预效果不明显。

表4 灌胃前OFT 行为指标分析Table 4 Analysis of behavioral indexes of OFT before intragastric administration

表5 灌胃后OFT 行为指标分析Table 5 Analysis of behavioral indexes of OFT after intragastric administration

由表6 可知，各组间大鼠在28 d 灌胃期前的EPM 行为指标均无显著性差异（>0.05），28 d 灌胃期后各组大鼠在EPM 的行为指标分析如表7 所示。与C 组和MC 组相比，NP 组大鼠入臂总次数、进入开臂的次数和时间均显著或极显著减少（<0.05或<0.01），说明NP 染毒使大鼠产生了焦虑情绪，造模成功。与NP 组相比，M 组、A 组和R 组大鼠入臂总次数、进入开臂的次数和时间均有显著或极显著提高（<0.05 或<0.01），AR 组的入臂总次数和进入开臂的次数也显著提高（<0.05），这些结果说明四个干预组对大鼠焦虑均有一定的干预效果。

表6 灌胃前EPM 行为指标分析Table 6 Analysis of behavioral indexes of EPM before intragastric administration

表7 灌胃后EPM 行为指标分析Table 7 Analysis of behavioral indexes of EPM after intragastric administration

综上所述，OFT 和EPM 测试结果同时说明NP 暴露会导致大鼠的焦虑行为。NP 暴露后可能会在蓄积大脑中并导致神经元细胞排列紊乱和胞核固缩，随着暴露浓度越高，脑组织中NP 蓄积浓度越高。结合本研究中NP 暴露后大脑系数显著增加的结果，推测NP 可能通过蓄积在大脑中对神经元产生损伤，从而产生神经行为毒性。杨婕发现桑葚粗提液能够显著增加大鼠在OFT 测试中进入旷场中心区域次数，还可以显著提高EPM 测试中进入开臂的次数和时间，说明桑葚粗提液能够改善焦虑程度，本研究结果与之一致。

2.5 桑葚多酚类物质对NP 染毒后大鼠甲状腺激素的影响

桑葚粗提液、花青素及白藜芦醇对各组大鼠血清中FT3、FT4 和TSH 水平的影响如图3 所示。与C 组和MC 组相比，NP 组大鼠血清中的FT3、FT4和TSH 都有极显著降低（<0.01），说明NP 对甲状腺激素和促甲状腺激素的分泌产生了干扰。干预组中，M 组和AR 组与NP 组大鼠相比，血清中FT3、FT4 和TSH 水平都有显著回升（<0.05 或<0.01），R 组大鼠血清中的FT3 水平有极显著的上升（<0.01），说明桑葚粗提液干预和联合干预能够在一定程度上缓解NP 对甲状腺激素和促甲状腺激素的影响。

图3 桑葚多酚类物质对NP 染毒大鼠血清中甲状腺激素的影响Fig.3 Effects of mulberry polyphenols on thyroid hormone in serum of rats exposed to NP

2.6 桑葚多酚类物质对NP 染毒后大鼠脱碘酶的影响

桑葚粗提液、花青素及白藜芦醇对各组大鼠肝脏中脱碘酶DIO1、DIO2 和DIO3 水平的影响如图4所示。与C 组相比，NP 组、R 组和AR 组大鼠肝脏内的DIO1、DIO2 和DIO3 水平均显著或极显著增加（<0.05 或<0.01），说明NP 暴露引起了大鼠肝脏中脱碘酶表达异常，花青素及联合干预没能逆转NP 诱导的脱碘酶升高。M 组和A 组大鼠肝脏中DIO1、DIO2 和DIO3 水平与对照组相比没有显著性差异（>0.05），与NP 组相比均有下降的趋势，但无显著性差异（>0.05），说明桑葚粗提液和花青素对大鼠肝脏脱碘酶的干预有一定效果，但不是很明显。

图4 桑葚多酚类物质对NP 染毒大鼠脱碘酶的影响Fig.4 Effects of mulberry polyphenols on deiodinase in rats exposed to NP

3 讨论与结论

本研究中，连续28 d 的NP 暴露导致大鼠体重和食物利用率明显降低，而四组干预组中白藜芦醇组对体重变化的改善最明显，其他三个干预组也有所改善，但程度不大。另外，桑葚干预组的食物利用率明显高于NP 组且恢复到与C 组相当的水平，而其余三组恢复程度不明显。结果说明桑葚粗提液可以改善NP 导致的食物利用率降低，而白藜芦醇的干预作用更好地体现在了体重的恢复上，先前的研究亦显示，白藜芦醇能够在一定程度上改善环磷酰胺引起的免疫力低下导致的小鼠体重下降。

脏器系数是评价毒性作用的常用指标，能够在一定程度上反映实验动物的机能状态和内脏器官的病理变化。从本实验的脏器系数结果来看，NP 暴露后的大鼠肝脏系数、肾脏系数和大脑系数均显著增加，这可能是因为NP 是脂溶性物质，容易蓄积于脏器，从而导致脏器出现充血、水肿或肥大等变化。A 组肝脏系数的干预效果最明显，可能是花青素发挥了调节促凋亡蛋白和促炎因子的作用，从而减轻肝脏的炎症反应。然而，四组干预物质对NP 导致的肾脏和大脑系数的增加无显著的逆转效果，这表明在一定程度上，桑葚多酚类物质未能有效缓解NP 所致肾脏和大脑的形态学变化。

OFT 和EPM 实验是评估大鼠神经行为状态的经典手段，可以通过大鼠在OFT 中进入中心区活动的时间和距离或在EPM 中进入的开臂次数和停留时间等指标来评估其焦虑状态，在OFT 中心区活动越少，或进入EPM 开臂次数越少，说明大鼠的焦虑程度越高。本研究中，NP 组大鼠与C 组和MC 组相比，在OFT 中活动的总路程、直立次数和进入中心区次数明显减少，在EPM 中进入开臂的次数和停留时间也明显降低，表明NP 暴露可引起大鼠焦虑情绪。而在桑葚粗提液和多酚类物质干预后，上述指标均有一定程度的提高，并恢复到对照组水平，说明干预组大鼠的焦虑水平被有效缓解。多酚类物质能够对焦虑抑郁情绪有一定的缓解作用，例如富含多酚的黑果海葵汁能够显著增加大鼠在EPM 中进入开臂的时间和次数，且具有剂量-效应关系，对大鼠具有明显的抗焦虑作用；黑莓汁中的花青素对大鼠也有镇定和抗焦虑的作用，而且在一定剂量下可达到抗焦虑药物相似的效果；白藜芦醇也具有多种治疗作用，如抗氧化、抗炎、神经保护等。

甲状腺激素对于大脑发挥正常功能有着重要的作用，而内分泌干扰物会影响甲状腺激素的水平，进而影响大脑的神经系统。有报道称甲状腺激素的降低会导致海马体神经元突触结构生长缓慢，造成记忆力下降和认知障碍。本研究结果显示，与C 组和MC 组相比，大鼠在暴露于NP 后血清中FT3、FT4和TSH 水平极显著下降，说明NP 可能对大鼠的甲状腺造成了一定的损伤。与NP 组相比，桑葚粗提液干预、花青素和白藜芦醇联合干预都能显著或极显著提高FT3、FT4 和TSH 的水平（<0.05 或<0.01），白藜芦醇单独处理也能显著提高FT3 的水平（<0.05），而花青素单独处理后，FT3、FT4 和TSH 均没有明显回升。研究显示，白藜芦醇能够通过改善甲状腺功能减退大鼠血浆TSH水平和下丘脑促甲状腺激素释放激素（TRH）水平，从而改善其学习记忆能力。因此，推测桑葚多酚类物质可能是通过调控大鼠体内甲状腺激素和TSH 水平等，减少NP 导致的神经毒性，从而缓解焦虑情绪。

脱碘酶的作用在于维持甲状腺激素水平的稳定。本研究结果显示，NP 染毒后大鼠肝脏中的脱碘酶DIO1、DIO2 和DIO3 水平与对照组相比均显著升高（<0.05）。经过桑葚粗提液和花青素干预后，三种脱碘酶的水平均有下降趋势，且与对照组无显著性差异，而白藜芦醇和联合干预后三种脱碘酶水平还是显著高于对照组。结果提示桑葚粗提液和花青素对肝脏脱碘酶水平有一定的调节作用，其对NP 染毒大鼠的干预效应可能是通过调节甲状腺激素和脱碘酶水平的稳态、改善大鼠的焦虑情绪，从而达到减轻神经行为毒性的途径来实现的。

综上所述，NP 短期重复染毒可导致大鼠体重和食物利用率下降，部分脏器损伤，焦虑行为，血清FT3、FT4 和TSH 水平的降低和肝脏DIO1、DIO2和DIO3 水平的升高。桑葚粗提液及其主要多酚成分花青素和白藜芦醇可以有效缓解NP 所致的有害作用，推测其中的机制可能是桑葚多酚类物质可以通过调节甲状腺激素水平稳态达到减轻神经行为毒性的干预效果。