脂联素基因多态性与壮族绝经后女性骨质疏松症的相关性

周庆辉，王金花，李嘉慧，莫颂秩

(1.右江民族医学院人体学与解剖学教研室，广西 百色 533000；2.右江民族医学院组织学与胚胎学教研室，广西 百色 533000；3.右江民族医学院病原微生物学与免疫学教研室，广西 百色 533000)

脂联素(adiponectin)主要是由脂肪细胞合成和分泌的一种激素蛋白，经与其受体结合而在脂质代谢、调节胰岛素抵抗和抗动脉粥样硬化等方面起着关键作用[1]。有研究发现血浆脂联素水平与骨密度和骨转换生化标志物水平相关[2-4]，且脂联素和其受体AdipoR1蛋白表可达于成骨细胞[5-6]和破骨细胞前体细胞[7]，表明脂联素直接参与调节骨生成和骨转换。随后在机制研究上发现脂联素在促进前成骨细胞分化和矿化能力方面可能起着积极作用，同时降低破骨细胞前体的成熟能力[8]。在基因层面也有报道脂联素基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)与股骨颈和前臂的低骨密度[9]及广西仫佬族中老年人的骨量减少[10]相关，SNPs可能会引起脂联素基因的表达变化，进而改变其在循环或局部组织中的蛋白水平而影响骨转换。骨组织中破骨细胞的骨吸收与成骨细胞的骨生成之间失衡使骨吸收大于骨生成时，则易导致骨质疏松。骨质疏松症更易发于雌激素水平明显下降的绝经后妇女，使其存在较高的骨折风险，本研究旨在探寻与壮族绝经后妇女骨质疏松密切相关的脂联素基因SNPs位点，为后续研究分析其多态性对血循环和骨组织中脂联素蛋白表达的影响奠定基础。

1 对象与方法

1.1 对象与分组 为2016年5月～12月在广西百色、河池、崇左和南宁地区招募55～70岁壮族绝经后女性志愿者373名， 平均年龄(61.61±4.57)岁。研究对象之间无亲属血缘关系，且排除心肾肝肺等慢性疾病患者、内分泌疾病患者以及1年内用过影响骨代谢的药物者。采样过程遵循知情同意原则。研究对象依据2017年《原发性骨质疏松症诊疗指南》的标准[11](T值>-1.0 为骨量正常；-2.5

1.2 方法

1.2.1 超声骨密度测定 记录调查对象的一般情况包括出生日期、绝经情况、既往病史、近1年内药物使用情况等，测量身高和体重。骨密度以法国Osteospace干式超声骨密度仪测量左侧跟骨所得的超声振幅衰减(broadband ultrasound attenuation，BUA)表示。为了保证BUA数据的准确性，检测由专人负责，每次开机使用标准模块进行质量检测，不同采样地点标准模块BUA测量值之间的误差控制在1%之内。

1.2.2 PCR扩增 对采集的研究对象血样进行DNA提取，采用Multiplex SNaPshot SNP分型技术对373个样本的DNA进行脂联素基因rs1063539G>C、rs266729C>G、rs3774261A>G和rs710445A>G位点的检测。PCR扩增反应的引物由上海天昊生物科技有限公司合成(见表1)。多重PCR反应(HotStarTaq，Qiagen公司)的产物经虾碱酶(SAP，Promega公司) 和外切酶Ⅰ(EXO Ⅰ，Epicentre公司)纯化后用SNaPshot Multiplex kit(ABI公司)进行延伸反应。延伸反应条件：96 ℃ 1 min；28个循环(96 ℃ 10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s)；4 ℃ 终止。延伸产物用虾碱酶(SAP，Promega公司)纯化后在ABI3130xl上样。SNP分型用GeneMapper4.0(Appliedbiosystems)分析。

表1 Multiplex SNaPshot引物序列

2 结果

2.1 脂联素基因多态性的分布频率分析 广西壮族女性人群脂联素基因rs1063539、rs266729、rs3774261和rs710445位点存在基因多态性分布，骨量正常组人群脂联素基因4个位点的基因型频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(χ2值分别为0.01、0.08、1.13和0.72，P>0.05)。χ2检验结果表明rs1063539位点的3种基因型在骨量正常、骨量减少和骨质疏松3组人群中的分布差异有统计学意义 (P<0.05)，见表2。

表2 壮族绝经后妇女脂联素SNPs位点的基因型在骨量正常、骨量减少和骨质疏松3组人群中的分布

2.2 脂联素基因多态性与跟骨超声骨密度的关系 单因素方差分析显示，脂联素基因rs710445位点基因型间的跟骨BUA值差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 壮族绝经后妇女脂联素基因SNPs位点的基因型间BUA比较 单位：db/MHz

表3(续) 壮族绝经后妇女脂联素基因SNPs位点的基因型间BUA比较 单位：db/MHz

2.3 脂联素基因SNPs与骨质疏松症的相关性分析 以骨量正常、骨量减少和骨质疏松分组为因变量，rs1063539、rs266729、rs3774261和rs710445位点的基因型为自变量，年龄和体质指数为协变量进行回归有序分析，结果显示随着年龄增大，发生骨质疏松症的风险增加，而体重指数则相反；rs1063539 CC和CG基因型(以GG基因型为参照)是骨质疏松的危险因素(P<0.05)；rs710445 AA和AG基因型(以GG基因型为参照)是骨质疏松的保护因素(P<0.05)，见表4。

表4 骨质疏松症危险因素的有序Logistic回归分析

2.4 连锁不平衡分析 结果显示4个位点之间不存在强连锁，故后续不再进行单倍型分析，见表5。

表5 脂联素基因SNPs连锁不平衡分析

3 讨论

脂联素在血浆中主要以低分子量的三聚体、中分子量的六聚体和高分子量多聚体形式存在[13]。血清脂联素水平在绝经前期、绝经过渡期、绝经后早期和绝经后晚期呈“U”形变化，在绝经过渡期最低[14]，GHADGE A A等[15]研究也表明绝经后血清脂联素水平升高；国内最近的研究报道骨质疏松人群的脂联素水平明显高于正常对照，且脂联素与腰椎及髋部BMD呈负相关[16]。由此表明，血清脂联素水平在雌激素缺乏条件下升高，并与骨量丢失相关。也有文献报道循环中的高分子量脂联素水平与绝经后女性的股骨颈骨密度和全身骨密度呈负相关，而与雌二醇水平无关[17]，但该研究仅测量高分子量脂联素且有半数研究对象服用对脂联素有影响的他汀类药物。脂联素对成骨细胞和破骨细胞作用的基础研究显示在体外脂联素激活其受体可促进成骨细胞和成骨细胞祖细胞的成骨作用；也可通过破骨细胞前体上的AR1直接抑制破骨细胞的生成[18]，同时在体内脂联素通过下调成骨细胞分泌的RANKL间接抑制破骨细胞的生成[19]；CHINA S P等[20]研究也展示了球状脂联素对雌激素缺乏引起的骨质疏松症、肌细胞减少症和胰岛素抵抗有治疗作用。上述研究中绝经后女性和骨质疏松人群的血清脂联素水平升高，并与骨密度呈负相关未能与脂联素对成骨细胞和破骨细胞的作用相吻合，可能与骨细胞上脂联素受体2的缺失或低表达、球状脂联素对脂联素受体1的亲和力高于其他形式的脂联素[21]有关。在遗传层面，基因多态性或突变可能会影响蛋白质的表达，因此，在绝经后雌激素水平显著降低条件下的骨重塑可能受脂联素基因多态性所致的浓度变化影响。最近的研究报道在糖尿病患者中携带脂联素基因rs2241766 T等位基因和TT基因型的个体发生血糖控制不佳的比例更高，且rs2241766 TT基因型的个体血清脂联素水平显著降低[22]，表明脂联素基因多态性与其血清水平相关。本课题组之前的研究发现脂联素基因rs1063539位点多态性与壮族女性骨量减少存在相关性[23]，为进一步明确脂联素基因SNPs与广西壮族绝经后女性骨质疏松症的相关性，本课题组在原采集样本地区以外的百色德保县、河池宜州区、崇左大新县和天等县及南宁武鸣区招募志愿者进行超声骨密度检测和血样采集，并选择55～70岁的绝经后女性以减少年龄跨度过大引起的偏差。

本研究结果表明随着年龄的增大，壮族绝经后女性发生骨质疏松症的风险增加，而体重指数则是保护因素；除了证实在骨量正常、骨量减少和骨质疏松3组的对比中rs1063539位点的CC、CG和GG基因型的分布有明显差异之外，还发现了rs710445位点多态性与骨密度密切相关，其AA和AG基因型的跟骨超声骨密度值明显比GG基因型的高。在此基础上进一步作骨质疏松症危险因素的有序回归分析发现携带rs1063539 CC和CG基因型的壮族绝经后女性发生骨质疏松的风险均比GG基因型的高，分别是GG基因型的4.415和1.968倍，rs710445位点的 GG基因型是增加骨质疏松发生的危险因素。从基因功能结构区分析发现rs1063539位点位于脂联素基因的3’UTR区，该区域的功能可能是与不同的miRNA结合而改变染色质状态和调控基序，rs1063539位点的SNPs可能会影响miRNA与DNA该区域的结合，继而影响染色质的状态和脂联素基因的转录。虽然有研究报道rs1063539不同基因型间血清脂联素水平没有明显差异[24]，但脂联素可通过内分泌、旁分泌和自分泌途径调节骨的生成[25]，因此可能在局部组织中因等位基因的突变而存在表达差异。目前未见血清与骨组织中脂联素水平对比的报道。脂联素基因rs710445位点位于第1内含子序列中的增强子区，增强子是调控基因表达重要顺式作用元件之一，可以增强目标基因的转录效率。因此rs710445位点的单核苷酸多态性可能与脂联素基因的转录效率相关。有研究发现广西仫佬族中老年人的rs710445 GA和GG基因型与骨量丢失风险相关[10]，但未显示rs710445位点3种基因型之间的骨密度比较存在统计学意义上的差异。此外，目前少见有研究文献报道rs710445位点多态性与其它疾病或脂联素水平存在相关性。鉴于脂联素存在形式的多样及其对骨调节作用上存在的不一致，后续研究需要考虑脂联素血浆水平(主要由脂肪细胞分泌)与局部组织水平(自分泌和旁分泌)可能存在的差异及以何种多聚体形式激活受体发挥作用。因本研究未对血清和骨组织的脂联素水平进行检测，后续可依据rs1063539和rs710445位点的基因多态性开展血清和骨组织脂联素表达水平的对比研究。

综上所述，众多的研究证实了脂联素通过激活其受体在调节骨生成和骨吸收方面扮演重要角色，本研究结果也从遗传基础方面表明脂联素基因rs1063539 C/G和rs710445 A/G的基因多态性与广西壮族绝经后女性的骨质疏松症密切相关，其中rs1063539 CC、CG基因型和rs710445 GG基因型可能是增加骨质疏松风险的遗传因素。