TLR4/NF-κB 通路在慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉和不伴鼻息肉的黏膜上皮修复机制中的作用

刘亮亮，文 华，杨 瑾，卢媛媛，王正辉

（1.西安交通大学医院眼耳鼻咽喉科，陕西 西安 710049；2.西安交通大学医院公共卫生中心，陕西 西安 710049；3.西安交通大学医院妇产科，陕西 西安 710049；4.西安交通大学第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科病院，陕西 西安 710004）

慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP）和慢性鼻-鼻窦炎不伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP）是临床上常见的鼻腔、鼻窦炎性病症慢性鼻-鼻窦炎（chronic rhinosinusitis，CRS）的2 个亚型。既往的研究表明CRSwNP 和CRSsNP 在发病机制、治疗、预后等方面存在明显差异[1]；但近来的研究证实[2]，鼻窦黏膜上皮细胞损伤、黏膜脱落是两者共同的病理学特征改变。Stevens WW 等[3]研究证实，鼻窦黏膜损伤后，上皮细胞自行的异常修复直接导致鼻粘膜组织结构的改变，进而影响鼻窦黏膜组织功能的改变以及鼻窦病变的产生。细胞中的多种蛋白因子或者参与，或者直接调控了上皮细胞损伤后的自行修复。表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）能够刺激上皮细胞的增殖，调控细胞的粘附和迁移在鼻窦黏膜损伤后修复中发挥关键性作用[4]。Toll 样受体4/核转录因子-κB（TLR4/NF-κB）通路是广泛存在细胞内的信号转导通路，在细胞的增殖与凋亡，损伤与修复、炎性与应激等生理过程中发挥了重要作用[5]。研究表明[6]，细胞损伤后，TLR4/NF-κB通路被激活，驱动炎性细胞因子的大量产生，进而加重炎性反应。Zhang QI 等[7]通过临床研究证实，TLR4在CRS 的2 个压型CRSwNP 和CRSsNP 存在表达差异的现象。而TLR4/NF-κB 在CRS 中鼻窦黏膜上皮细胞增殖作用的报道罕见。本研究旨在探讨TLR4/NF-κB 信号通路对CRSwNP 和CRSsNP 中鼻窦黏膜上皮细胞增殖的作用，以期为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 组织标本 收集2018 年3 月-2021 年9 月就诊于西安交通大学附属医院耳鼻咽喉科且在鼻内镜下接受手术治疗的30 例患者的鼻筛窦黏膜上皮组织。将CRS 患者标本组分为CRSsNP 组和CRSwNP 组，每组10 例。CRSsNP 组男6 例，女4 例；年龄19～56岁，中位年龄43 岁；CRSwNP 组男7 例，女3 例；年龄22～58 岁，中位年龄45 岁；对照组标本来源于进行视觉性鼻整形术的10 例患者，男5 例，女5 例；年龄22～48 岁，中位年龄44 岁，术中所见均无鼻窦炎症性疾病。各组患者的性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；且经鼻窦CT 检测，无支气管哮喘、糖尿病并发症、阿司匹林耐受不良、鼻窦真菌或细菌或病毒感染、妊娠、恶性肿瘤以及鼻绒毛不动综合症和免疫功能缺陷症等，所有患者均未首次采用鼻内镜手术，术前均未曾使用激素或者抗组胺类药物。本研究中患者的诊断均参照EPOS-2012（2012 欧洲CRS 科研与诊断意见书）的标准进行，对照组患者均无鼻窦炎性病症。

1.2 细胞及主要试剂和仪器 TLR4/NF-κB 信号通路抑制剂PDTC（美国Selleckchem 公司），多聚甲醛（南京卓普生物科技有限公司），DMEM 培养基（Gibco 公司）；HE 染色剂（Thermo Fisher scientific 公司）；胰蛋白酶（Amersco 公司）；TLR4、NF-κB 抗体（Santa Cruz，CA，USA）；免疫组化试剂盒、CCK-8 试剂盒（Thermo 公司）。CO2细胞培养箱（SHELLAB 公司，美国），细胞培养板（美国Costar 公司），MK3 酶标仪（日本岛津公司），超净工作台（北京六一仪器厂），LEICA激光共聚焦荧光显微镜（德国徕卡公司）。

1.3 HE 染色鼻黏膜组织病理学观察 从样品中取等量的后组筛窦黏膜上皮组织，10%多聚甲醛固定，HE 染色，光学显微镜下观察各组鼻黏膜组织病理学改变情况。

1.4 免疫组化法检测TLR4 以及NF-κB 的蛋白表达从样品中取等量的前组筛窦黏膜上皮组织，常规固定包埋并切片，用二甲苯和梯度乙醇脱蜡后置于柠檬酸盐缓冲液中进行修复，以充分暴露抗原决定簇。然后用3%的双氧水室温下浸泡10 min，封闭，分别加稀释好的一抗4 ℃过夜孵育，次日冲洗干净，分别加入适量生物素标记的二抗室温孵育30 min，清洗。加适量二氨基联苯胺（DAB）作用2～5 min 后用去离子水终止反应，苏木素复染1.5～2 min，清洗后于乙醇梯度脱水，二甲苯浸泡并干燥后用中性树胶封片，镜检观察并记录实验结果；染色评判标准以肿瘤细胞细胞膜和细胞质内出现黄色或棕黄色颗粒为阳性，每个切片随机取10 个400 倍视野，以100 个细胞为计数单位，按染色面积及细胞被染色强度计分，计分原则如下：染色面积范围≤10%为0 分，＞10%～25%为1 分，＞25%～50%为2 分，＞5%～75%为3 分，＞75%为4 分；细胞无染色0 分，弱黄色1 分，黄色染色2 分，棕黄色3 分。若两者积分之和大于或等于3 分则为阳性，低于3 分则为阴性。切片的结果由肿瘤院病理科两位医师双盲阅片，单独评分，最后统一汇总，对有争议的评分需要经病理科两位以上主任复核修订，得到最终结果。

1.5 鼻粘膜上皮细胞的提取以及离体培养 从样品中取等量的中组筛窦黏膜上皮组织，无菌生理盐水清洗3 次，维持4 ℃置于胰蛋白酶（trypsin，浓度0.25%）和乙二胺四乙酸（EDTA，浓度0.01%）混合液中15～20 h，1000 rpm 离心3 min 去掉上清液，PBS缓冲液冲洗沉淀物3 次，加入200 ml 以3∶1 比例的含10%胎牛血清的DMEM 和Ham's F 的培养液以悬浮细胞，放置于温度37℃、5%CO2细胞培养箱中常规培养。

1.6 CCK-8 法检测鼻黏膜上皮细胞的增殖 当细胞单层生长接近完全融合时，将细胞制成单细胞悬液，以1×105个/ml 的浓度接种在96 孔培养板中，置于温度37 ℃、5%CO2细胞培养箱中24 h 后，分组依次进行CCK-8 实验。本试验分为4 组，各组添加等体积的相同浓度的细胞培养液，分别施加以下4 种刺激因素[8]：空白对照组；EGF 组（添加5 ng/ml EGF，剂量50 ml）；TLR4/NF-κB 组（依次添加5 ng/ml TLR4 和NF-κB 培养24 h 后，添加5 ng/ml EGF）；PDTC 组（添加5 ng/ml 信号通路抑制剂PDTC 培养12 h 后，添加5ng/ml TLR4 和NF-κB 培养12 h 后，添加5 ng/ml EGF），37℃，5%CO2生化培养箱中继续培养4 h，然后每孔加入20 μl CCK-8 溶液后再恒温孵育5 h，待完全显色后，100 rpm，10 min，弃掉上清液，Multiskan MK3 酶标仪在450 nm 处检测吸光值A。

1.7 ELISA 检测各组鼻黏膜上皮细胞中IL-β、IL-5的表达 调整细胞浓度至1×104个/ml 接种于24 孔板中，分组处理1.6，37 ℃，5%CO2生化培养箱中继续培养24 h，ELISA 试剂盒检测各组细胞中IL-β、IL-5 的水平；每个样本独立重复测量3 次。

1.8 统计学分析 本研究数据分析采用SPSS 16.0，作图工具采用Graphpad 5.01，免疫组化结果采用秩和检验，3 组样本间的差异比较采用Kruskal-Wallis分析，两两样本间的比较采用Mann WhitneyU检验。不同刺激条件下的结果分析采用方差分析，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRS 患者CT 检查 CRSsNP 和CRSwNP 组典型的实体和CT 检查见图1，依照[9]Lund-Mackay 方法进行评分。对两组患者鼻窦以及其复合体分别评分，正常记为0 分，部分阴影记为1 分，全部阴影记为2分。评分结果显示，与CRSsNP 组（7.76±4.66）分相比，CRSwNP 组的鼻窦CT 评分为（16.82±8.25）分。从CT 检查来看CRSwNP 组患者具有更为严重的鼻腔、鼻窦黏膜病变。

图1 典型的CRSsNP 和CRSwNP 实体图（SP×200）及其对应CT 图

2.2 HE 鼻黏膜组织病理学观察 对照组患者的鼻粘膜组织结构完整，假复层柱状纤毛清晰可辨，纤毛粗细均匀，排列整齐，黏膜下层的纤维结缔组织少量分布，黏膜上皮细胞排列均匀，结构完整；CRSsNP 组患者的鼻粘膜组织纤毛紊乱，粗细不一，假复层柱状和复层鳞状结构同时存在，上皮细胞基质增厚明显，细胞间质明显水肿，大量炎性细胞浸润，以中性粒细胞浸润为主，成纤维细胞明显增多，杯状细胞数量明显增多；CRSwNP 组患者的鼻粘膜组织上皮细胞结构不完整，甚至有脱落现象，杯状细胞数量增多，黏膜基膜增厚，黏膜固有层可见嗜酸性炎性细胞大量浸润，腺体肿大明显，数量明显减少，息肉中无神经结构出现且无新生血管，见图2。

图2 HE 染色病理图片（SP×400）

2.3 免疫组化法检测TLR4 以及NF-κB 的蛋白表达免疫组化法检测TLR4 以及NF-κB 的蛋白表达结果见图3，TLR4 主要在胞膜和胞质内大量表达，鼻黏膜假复层柱状纤毛上皮中大量分布，染成棕黄色；NF-κB 主要在胞核和胞质内大量表达，鼻黏膜假复层柱状纤毛上皮以及固有腺体细胞中大量分布。与对照组患者相比，CRSsNP 组、CRSwNP 组患者的鼻粘膜组织中TLR4、NF-κB 的表达量升高（P＜0.05）；与CRSsNP 组患者相比，CRSwNP 组患者的鼻粘膜组织中TLR4、NF-κB 的表达量升高（P＜0.05）。

图3 免疫组化法检测TLR4 以及NF-κB 的蛋白表达（SP×400）

2.4 CCK-8 法检测各组黏膜上皮细胞的增殖活性利用CCK-8 法检测TLR4/NF-κB 信号通路及抑制剂对鼻黏膜上皮细胞增殖的作用，结果见图4，与对照组相比，CRS 患者鼻粘膜上皮细胞的增殖基线降低（P＜0.05）；与CRSsNP 组相比，CRSwNP 组患者鼻粘膜上皮细胞的增殖基线升高（P＜0.05）；对照组和CRS 组加入EGF 后，与空白对照相比，鼻粘膜上皮细胞的增殖基线升高（P＜0.05）；加入TLR4 和NFκB 后，与空白对照相比，鼻粘膜上皮细胞的增殖基线降低（P＜0.05），说明加入TLR4 和NF-κB 明显抑制了EGF 对鼻粘膜上皮细胞的增殖作用；加入PDTC 后，EGF 诱导细胞增殖的作用有所恢复（P＜0.05）。说明TLR4 和NF-κB 抑制了对照组和CRS组鼻粘膜上皮细胞的增殖，但是PDTC 可以减弱这种抑制作用，。

图4 CCK-8 法检测各组黏膜上皮细胞的增殖活性

2.5 各组黏膜上皮细胞炎性因子IL-β、IL-5 的表达情况 ELISA 试剂盒检测各组细胞中IL-β、IL-5 的水平，结果见图5，与对照组相比，CRS 组患者鼻粘膜上皮细胞中IL-β、IL-5 的水平升高（P＜0.05）；与CRSsNP 组相比，CRSwNP 组患者鼻粘膜上皮细胞中IL-β、IL-5 的水平升高（P＜0.05）；对照组和CRS 组加入EGF 后，与空白对照相比，鼻粘膜上皮细胞中IL-β、IL-5 的水平降低（P＜0.05）；加入TLR4 和NFκB 后，与空白对照相比，鼻粘膜上皮细胞中IL-β、IL-5 的水平升高（P＜0.05），说明加入TLR4 和NFκB 明显激活了鼻粘膜上皮细胞的炎症作用；加入PDTC 后，鼻粘膜上皮细胞中IL-β、IL-5 的水平明显有所降低（P＜0.05）。说明TLR4 和NF-κB 明显激活了鼻粘膜上皮细胞的炎症作用，但是PDTC 可以减弱这种激活作用。

图5 ELISA 试剂盒检测各组细胞中IL-β、1L-5 的水平

3 讨论

CRSsNP 和CRSwNP 都是上呼吸道系统炎性疾病，目前关于CRSsNP 和CRSwNP 的发病机制存在变态反应、免疫失衡、微生物膜感染等多种假说[10]，具体发病机制仍未明确。由于两者在患者主观感受、临床表现、组织病理、治疗以及预后方面的诸多差异，将两者同时同步研究的报道较少[11]。近来研究表明[12]，诸多信号通路在CRSsNP 和CRSwNP 的上皮细胞修复中发挥趋势一致的作用。本研究中亦从CRSsNP 和CRSwNP 两种疾病的鼻粘膜上皮细胞损伤与修复的角度出发，寻找可以治疗CRSsNP 和CRSwNP 两者的靶向位点。

临床研究表明[13]，CT 检查评分以及HE 染色观察是目前针对CRS 患者病变程度的客观评价的重要手段。本研究针对CRSsNP 和CRSwNP 的CT 检查表明，与CRSsNP 组（7.76±4.66）分相比，CRSwNP组的鼻窦CT 评分为（16.82±8.25）分，推断CRSwNP组患者具有更为严重的鼻腔、鼻窦黏膜病变。HE 观察结果对照组患者的鼻粘膜组织结构完整，CRSsNP组患者鼻粘膜组织纤毛紊乱，以中性粒细胞浸润为主，成纤维细胞明显增多，杯状细胞数量明显增多，CRSwNP 组患者的鼻粘膜组织杯状细胞数量增多，黏膜基膜增厚，黏膜固有层可见嗜酸性炎性细胞大量浸润，腺体肿大明显，数量明显减少，息肉中无神经结构出现且无新生血管。因此，推断CRSwNP 组患者的鼻粘膜病理更为严重。

对CRS 的信号通路的研究能更从更深层次的揭示患者的发病机制，推断基因靶向治疗或者更准确的探针诊断。目前炎症信号通路TLR4/NF-κB 和炎症因子在CRS 中的作用引起广泛关注[14]。Hirschberg A 等[15]研究表明上调或者下调TLR4 的表达能明显CRSsNP 和CRSwNP 患者的发病和治疗及预后。Kaczmarek M 等[16]通过临床研究表明，Toll 样受体具有靶向治疗CRS 的潜力。华丽等[17]报道，抑制TLR4/NF-κB 信号通路能下调炎性递质的产生和释放。林甦等[18]研究证实，下调TLR4/NF-κB 信号通路的表达能明显减轻鼻粘膜的损害，抑制鼻粘膜的炎性反应，改善变应性鼻炎症状。但未见有TLR4/NF-κB 通路在鼻粘膜上皮细胞修复中的作用。

本研究中采用CCK-8 法检测各组鼻粘膜上皮细胞的增殖活性，结果表明对照组和CRS 组加入EGF 后，与空白对照相比，鼻粘膜上皮细胞的增殖基线升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；单独加入TLR4 和NF-κB 后，与空白对照相比，鼻粘膜上皮细胞的增殖基线降低，差异有统计学意义（P＜0.05），说明加入TLR4 和NF-κB 明显抑制了EGF 对鼻粘膜上皮细胞的增殖作用；加入PDTC 后，EGF 诱导细胞增值的作用有所恢复，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明TLR4 和NF-κB 抑制了对照组和CRS 组鼻粘膜上皮细胞的增殖，但是PDTC 可以阻断这种抑制作用。

炎症性病变是CRS 鼻粘膜上皮中最重要的病理改变。研究显示[19]，IL-β、IL-5 属于脂肪蛋白因子，也是黏膜上皮中重要的促炎因子，炎性因子的大量积累能够介导氧化应激、反馈激活炎症TLR4/NF-κB信号通路，使上皮细胞的损伤加剧[20]。胡琛等[21]研究表明，活化后的TLR4 能进一步诱导更广泛的级联反应激活NF-κB，使NF-κB 发生核移位，转导信号进入细胞核内，激活更多的细胞内炎症通路。研究显示[22]，NF-κB 被激活后，调控更多相关炎症因子基因的转录，调节IL-β、IL-5 等细胞因子的释放，更进一步放大炎症反应。本研究中采用ELISA 法检测炎性因子的表达，结果发现抑制TLR4/NF-κB 信号通路后能降低IL-β、IL-5 的表达（P＜0.05）。

总之，本研究证明TLR4/NF-κB 信号通路影响CRS 中CRSsNP 和CRSwNP 两者鼻粘膜上皮细胞损伤后的修复，抑制TLR4/NF-κB 信号通路能明显增强CRS 患者鼻粘膜上皮细胞的增殖作用。但是如何将这其中的作用机制应用到临床治疗CRSsNP 和CRSwNP 两者上阿托伐他汀还待进一步的研究。