禽蛋中甲硝唑残留的固相萃取-高效液相色谱-串联质谱检测方法建立

李 宁，肖 琎，苑中策，董洁琼，王圆圆，郑百芹，李 艺，霍路曼，张 谊，汤思凝，庞学良，葛 凯，李文杰，雷舒涵，李明阳，张书宏，郝立武

（1.唐山市食品药品综合检验检测中心，河北唐山 063000；2.遵化市畜牧水产技术服务中心，河北遵化 064200；3.唐山市农业综合行政执法支队，河北唐山 063000）

随着我国经济的快速发展，人民生活水平的日益提高，禽蛋作为人们从天然食物中摄取蛋白质的主要来源之一，其消费比例及消费量在不断提高。据有关资料[1]显示，2021年我国禽蛋产量为3 409万t，占世界总产量的40%左右。随着蛋禽养殖集约化、规模化的不断推进，疫病防控压力也不断增大。为了提高生产性能，兽用抗生素在蛋禽养殖过程中被广泛使用，但若不严格遵守兽用抗生素的休药期规定，很容易在禽蛋中造成兽药残留[2]。近年来，人们的食品安全意识不断提高，在饲料端“禁抗”，养殖端“减抗、限抗”的大形势下，禽蛋产品中的兽药抗生素残留问题成为全社会关注的焦点[3-5]。

甲硝唑（metronidazole，MNZ），又名灭滴灵，全名为甲硝羟乙唑，属于硝基咪唑类药物，性质稳定。甲硝唑是不带电荷的小分子化合物，在无氧条件下，分子中的硝基还原成氨基，生成有活性的高细胞毒中间体，杀灭微生物。因此，甲硝唑具有抗厌氧菌的作用，对需氧菌或兼性厌氧菌则无效。甲硝唑易进入中枢神经系统，是脑部厌氧菌感染的首选防治药物，不易形成耐药菌株，与常用抗生素联用无拮抗作用，可用于阿米巴原虫病和滴虫病防治，对治疗鸡生殖系统疾病及炎症效果较好[6-7]。甲硝唑对细胞有致突变、致癌作用。2017 年，世界卫生组织国际癌症研究所将甲硝唑列为2B 类致癌物[8]。我国《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》（GB 31650—2019）规定，甲硝唑允许作治疗用，但不得在动物性食品中检出[9-10]。

目前，供人们普遍食用的禽蛋主要有鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鹌鹑蛋等。禽蛋营养丰富，易被人体吸收且价格实惠，深受大众喜爱[11-12]。但目前禽蛋中甲硝唑的残留检测尚未有相应的国标方法，相关研究报道也较少[13]。已发表的文献也多为鸡蛋中甲硝唑残留检测方法，且存在前处理过程复杂，回收率不理想、不适合大批量禽蛋样品检测等问题。本研究建立并优化了禽蛋中甲硝唑药物残留的检测方法，以期为满足禽蛋中甲硝唑药物残留风险监测需求提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂耗材

AB Sciex ExionLC 高效液相色谱仪、AB Sciex Triple Quad 5500+三重四极杆联用质谱仪，美国AB SCIEX 公司；PRiME HLB 6cc（200 mg）固相萃取柱，美国waters 公司；JJ200A 分析天平，常熟市双杰测试仪器厂；KQ-800KDB 型高功率数控超声波清洗器，昆山市超声波仪器有限公司；VORTEX 3 涡旋混匀仪，德国IKA 公司；LYNX4000 冷冻离心机，赛默飞世尔科技有限公司；DN-12 水浴氮吹仪，杭州聚同电子有限公司；MFLN-30 氮气发生器，北京中惠普分析技术研究所；CSR-1-1011 超纯水机，北京爱思泰克科技开发有限公司。

甲硝唑（100 μg/mL）、甲硝唑-D4 同位素内标（100 μg/mL）标准物质，均购自天津阿尔塔科技有限公司；色谱纯甲醇、乙酸乙酯、乙腈、0.22 μm 尼龙滤膜，均购自美国Dikma 公司；五氟苯基（Kinetex F5）色谱柱，购自美国菲罗门Phenomenex 公司。

1.2 标准溶液配制及标准曲线绘制

取甲硝唑、甲硝唑-D4 同位素内标标准物质，以甲醇为溶剂，配制成10 000 μg/L 标准储备液，避光保存于-20 ℃冰箱；用甲醇-水（体积比1:1，下同）分别将甲硝唑、甲硝唑-D4 同位素内标标准储备液稀释为100 μg/L 标准工作液；准确移取甲硝唑标准工作液100 μL 至10 mL 容量瓶中，用甲醇-水（1:1）定容至刻度，配制成1 μg/L 标准工作液。

配制质量浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L 的甲硝唑标准溶液，各加入甲硝唑-D4 同位素内标（100 μg/L）标准工作液50 μL，上机检测，绘制标准曲线。

1.3 样品采集与前处理条件优化

随机采集唐山市周边各县（区）超市、农贸市场禽蛋样品。称取同批次禽蛋样品5 g 于50 mL离心管中，分别用10 mL 乙腈、甲醇、乙酸乙酯、乙腈-水（9:1）、乙腈-水（4:1）、乙酸乙酯-甲醇（19:1）、乙酸乙酯-甲醇（9:1）、乙酸乙酯-甲醇（4:1）充分提取；涡旋5 min，超声10 min，8 000 r/min 离心5 min，待净化。

1.4 净化

将4 mL 待净化溶液直接加入PRiME HLB 固相萃取柱，保持1 滴/s 流速，用10 mL EP 管收集流出液；加入1 mL 乙腈，3 000 r/min 涡旋混匀30 s，再次全部倒入PRiME HLB 固相萃取柱，用吸耳球吹尽固相萃取柱中的残余溶液；将收集的溶液45 ℃氮吹至1 mL 以内，用乙腈-水（1:9）定容至1 mL；涡旋混匀30 s，经0.22 μm 尼龙滤膜过滤后备用。

1.5 色谱条件与质谱条件的优化

分别试验以下流动相组合：0.1%甲酸水-甲醇、纯水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈、纯水-乙腈、0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈、0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇、纯水-0.1%甲酸乙腈、纯水-0.1%甲酸甲醇。通过比较不同的流动相搭配，分别进行等度洗脱和梯度洗脱，对甲硝唑及甲硝唑-D4 内标的响应度及峰形进行选择性优化。

AB Sciex Triple Quad 5500+三重四极杆联质谱仪在电喷雾离子源（ESI+）多反应监测模式（MRM）下，调整质谱条件参数，去簇电压分别在40、50、60、70 v，碰撞电压分别在15、20、22、25、30、35、37、40 v 等条件下进行优化选择，确定最适去簇电压和碰撞电压。

1.6 添加回收试验

选择超市或市场上常见的禽蛋（鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鹌鹑蛋）分别在定量限、2 倍定量限、10 倍定量限开展加标回收及精密度试验，每个定量限进行7 个水平测定，验证方法的回收率及重复性。

1.7 实际样品测定

应用建立的方法对唐山地区市售的2 098 份禽蛋样品进行甲硝唑残留检测，并利用进出口行业标准《动物源性食品中多种碱性药物残留量的检测方法 液相色谱—质谱/质谱法》（SN/T 2624—2010）进行复检，比较两种方法的符合性。

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制

配制质量浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L 的甲硝唑标准溶液进行检测，绘制标准曲线。结果显示，甲硝唑标准溶液在0.1～50.0 μg/L 检测范围内呈现良好的线性关系（图1），线性方程为Y=0.158 84X-0.001 58（R=0.999 90，R2=0.999 81）；甲硝唑在禽蛋中的检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.15 μg/kg 和0.50 μg/kg。

2.2 样品制备及前处理优化结果

将同批次的禽蛋样品（不少于5 枚）破壳后，蛋黄与蛋清打入同一洁净容器中，搅拌均匀；准确称取5 g 待测试样于50 mL 离心管中，加入50 μL甲硝唑-D4 同位素内标（100 ng/mL）标准工作液，同时加入9.5 mL 乙酸乙酯和0.5 mL 甲醇，震荡涡旋5 min，超声提取10 min；4 ℃ 8 000 r/min 离心5 min，取5 mL 上清液至10 mL EP 管中，45 ℃氮吹至近干，加入4 mL 乙腈水（4:1）充分涡旋（1 500 r/min）30 s，待用。

2.3 色谱条件及质谱条件优化结果

优化后的色谱条件为色谱柱：五氟苯基（Kinetex F5）色谱柱100A（2.6 μm，100 mm×2.1 mm）；柱温：40 ℃；进样体积：3 μL；流速：0.35 mL/min；流动相：水相为0.1%甲酸水，有机相为0.1%甲酸乙腈，梯度洗脱。HPLC 梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

优化后的质谱条件为电喷雾离子源（ESI+）模式；电喷雾电压（IS）5 500 V；离子源温度（TEM）：550 ℃；气帘气（CUR）：35 psi；碰撞气（CAD）：Medium；辅助气1（GS1）：50 psi；辅助气2（GS2）：50 psi；检测方式为多反应监测模式扫描（MRM）。甲硝唑定量离子和定性离子对、甲硝唑-D4 内标离子对信息见表2，0.50 μg/L 甲硝唑标准溶液及甲硝唑-D4 离子对图谱见图2。

表2 高效液相色谱-串联质谱分析参数

2.4 添加回收试验

选择市场上常见的禽蛋（鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鹌鹑蛋）分别在0.5、1.0、5.0 μg/kg 3 个定量限做添加回收试验。结果（表3）显示，该方法的回收率为93.70%～106.83%，相对标准偏差（RSD）为1.66%～3.80%，鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鹌鹑蛋的批内变异系数分别为2.92%、3.48%、3.79%、2.45%，批间变异系数分别为2.84%、2.57%、3.09%、3.68%，说明该方法重复性较好。鸡蛋空白样品和加标定量限为1.0 μg/kg 样品甲硝唑及甲硝唑-D4内标离子对图谱见图3、图4。

表3 禽蛋样品不同定量限的添加回收试验结果

2.5 实际样品测定结果

应用本研究建立的方法和SN/T 2624—2010中规定的方法对2 098 份禽蛋样品进行甲硝唑残留平行检测。结果显示：2 种方法均检出1 份甲硝唑残留样品，定性结果一致，定量结果分别为16.9 μg/kg 和15.6 μg/kg，结果相差8.3%，在允许偏差范围内。表明本研究建立的方法能够满足禽蛋产品中甲硝唑日常风险监测需求。

3 讨论

禽蛋样品兽药残留分析方法中常选用的提取液有乙腈、乙酸乙酯、乙腈-水的不同配比等。禽蛋样品呈液态，并富含蛋白质、脂类等物质，残留药物与蛋白质结合，不利于解离，影响待测物的提取效率。乙酸乙酯作为一种高效的提取试剂，可提取鸡蛋中残留的甲硝唑，但由于乙酸乙酯不具有沉淀蛋白的作用，所以提取过程中的禽蛋蛋白质难以沉淀。甲醇具有沉淀蛋白的作用，加入少量甲醇可沉淀蛋白质。本研究经过比较验证发现，以乙酸乙酯-甲醇（19:1）作为鸡蛋中甲硝唑残留提取液，效果较为理想。

PRiME HLB 固相萃取柱不需要提前活化，可节约检测时间，且具有吸附脂肪等杂质的功能，净化除脂效果较好。禽蛋样品经乙酸乙酯-甲醇提取、氮吹后，管底会残留少量油状物，若选用乙腈溶解残留油状物，油状物中的脂肪等杂质会完全溶于乙腈，并随着乙腈通过PRiME HLB 固相萃取柱，净化效果不理想；若选用乙腈-水（4:1）溶解残留油状物，会出现分层现象，脂肪等杂质沉在管底，虽然具有分离杂质的作用，但甲硝唑回收效果不理想。为了提高甲硝唑回收率，本研究发现，采用乙腈-水（4:1）先溶解油状物，再用乙腈溶解管底残留物，既提高了甲硝唑的回收率，又净化了油状物等杂质。

本研究建立的固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定禽蛋中甲硝唑残留的方法，操作简便快捷，固相萃取柱无需提前活化，节约检测时间；净化除脂效果良好，回收率更加稳定；内标法定量，比外标法定量结果更准确。可用于大批量禽蛋样品中甲硝唑残留的检测。