TPD52在HER-2阳性乳腺癌中的表达及其临床病理意义

左志博 邬万新 李 鑫 张 琳 杨宏杰 汪静宇 郭志琴 胡少青

乳腺癌中人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)过度表达或HER-2基因扩增，被称为HER-2阳性乳腺癌，占所有乳腺癌的15%～20%。它是一种高度侵袭性肿瘤，以HER-2介导的致癌途径激活为特征，这些致癌途径驱动细胞周期进展、血管生成、高侵袭和代谢重编程，由于肿瘤生长速度快，对细胞毒性化疗缺乏反应，因此预后较差[1]。在过去20年中，针对HER-2的靶向药物的引入显著改善了患者的预后，但并非所有患者都能治愈，抗HER-2治疗出现了耐药性是大多数治疗失败的原因。越来越多的研究显示，在多个系统的肿瘤中都发现了肿瘤蛋白D52(tumor proteins d52，TPD52)的表达过度，它影响着细胞的增殖、凋亡及肿瘤转移。本研究主要探讨TPD52在HER-2阳性乳腺癌中的表达状况并分析其与临床病理特征的相关性，探讨TPD52与肿瘤发生、发展的关系，为HER-2阳性乳腺癌患者的治疗提供新的靶点。

对象与方法

1.实验对象：石蜡组织选择2020年1～12月嘉兴市第一医院手术切除标本的120例患者，分为正常乳腺组织组30例、HER-2阴性乳腺癌组30例及HER-2阳性乳腺癌组60例，上述标本由两名病理医生在石蜡切片及免疫组化染色后独立评估。所有纳入对象术前未接受过放化疗等新辅助治疗，未合并其他恶性肿瘤，有完整的临床病理资料。本研究通过笔者医院医学伦理学委员会审批。

2.主要设备及试剂：选用LECIA轮转式石蜡切片机、Roche Benchmark XT全自动免疫组织化学仪及DAKO全自动染色封片机等。小鼠抗人单克隆抗体TPD52抗体购自英国Abcam公司，Cyclin D1抗体和EDTA抗原修复液等购自北京中杉金桥公司。

3.方法：所有组织标本进行连续切片，切片厚度为4μm。免疫组化使用Roche Benchmark XT全自动免疫组织化学仪进行染色，随后进行显微镜镜下阅片。以PBS缓冲液代替一抗为阴性对照，使用已知TPD52及Cyclin D1表达阳性的前列腺组织为阳性对照。

4.结果判读标准：根据肿瘤细胞阳性百分比和染色强度计算TPD52免疫组化染色评分[2]。染色强度评分标准：无染色为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。阳性百分比评分标准：<5%为0分；5%～25%(不含)为1分；25%～50%(不含)为2分；≥50%为3分。由同两名病理医生采用盲法单独阅片评分。将上述两个分值的乘积作为最终分值，定义TPD52表达水平如下：-(0～1分)、+(2～3分)、++(4～6分)及+++(>6分)。将-或+定义为无表达或低表达，++或+++定义为高表达。

5.统计学方法：应用SPSS 19.0统计学软件对数据进行统计分析，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.不同乳腺组织中TPD52的表达水平：免疫组织化学法显示TPD52蛋白阳性染色为棕黄色颗粒，定位于细胞质(图1)。TPD52在乳腺癌中的高表达率为44.4%(40/90)，高于正常乳腺组织(0)，差异有统计学意义(χ2=20.000，P<0.001)。TPD52在HER-2阳性乳腺癌中的高表达率为53.3%，高于HER-2阴性乳腺癌的26.7%，差异有统计学意义(χ2=5.760，P=0.024，表1)。

图1 TPD52在乳腺组织中的表达(Envison, ×400)A.正常乳腺组织；B.HER-2阳性乳腺癌低表达;C.HER-2阳性乳腺癌高表达

表1 TPD52在不同乳腺组织中的表达率[n(%)]

2.TPD52与HER-2阳性乳腺癌临床病理特征的关系：TPD52的表达与HER-2阳性乳腺癌患者的年龄、肿块直径、组织学分级无关，差异无统计学意义(P>0.05)，但与淋巴结转移、TNM分期、ki-67表达及Cyclin D1表达有关，差异均有统计学意义(P均<0.05)。有淋巴结转移者的TPD52高表达率高于无淋巴结转移者，差异有统计学意义(P=0.001)；TNM分期为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的TPD52高表达率逐步上升，3组间比较差异有统计学意义(P<0.001)；高ki-67表达者的TPD52高表达率高于低ki-67表达者，差异有统计学意义(P=0.019)；高Cyclin D1表达者的TPD52高表达率高于低Cyclin D1表达者，差异有统计学意义(P=0.019，表2)。

表2 HER-2阳性乳腺癌中的TPD52表达与临床病理特征[n(%)]

讨 论

乳腺癌是全球第2大癌症，发生率达到11.9%，它也是女性中发生率最高的癌症，占所有女性新发癌症的25.2%[3]。尽管医学研究取得了重要进展，乳腺癌患者的病死率已经得到了显著的改善，但是在伴有转移的情况下，其中位生存率依然很低。根据乳腺癌的临床病理和分子分型，目前将雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2 3种基因的表达作为乳腺癌个体化治疗的关键。人表皮生长因子受体2是表皮生长因子受体家族中的一种跨膜酪氨酸激酶受体，在20%的乳腺癌中出现了基因扩增或过表达，并且在缺乏系统性治疗的情况下与预后不良密切相关[4]。HER-2阳性乳腺癌有着更具侵袭性的组织病理学和临床特征，例如高组织学分级以及转移潜能增高，同时还激活各种细胞信号通路加速细胞增殖和凋亡抑制[5]。

近年来HER-2阳性乳腺癌也取得了很大进展，临床试验确立了单克隆抗体曲妥珠单抗作为HER-2阳性乳腺癌的治疗标准，除此之外还有低分子拉帕替尼和来那替尼也提供了额外的治疗选择[6]。曲妥珠单抗虽然可以显著改善乳腺癌患者的预后，也是HER-2靶向治疗的关键。然而，HER-2的表达并不保证对曲妥珠单抗或其他HER-2靶向治疗有临床疗效，在最初阶段或许有疗效，但很多最后出现了耐药与复发[7]。这种耐药的出现使得抗HER-2治疗成为临床治疗HER-2过表达型乳腺癌的难题。因此，针对HER-2及其药物治疗抵抗进行研究，寻找一些HER-2治疗相关线索，对改善HER-2阳性乳腺癌患者治疗效果会有巨大的帮助。

TPD52是一种含有螺旋序列的承载蛋白，在细胞增殖、凋亡、囊泡运输、肿瘤发生和转移中发挥重要作用[8]。TPD52位于染色体8q21，编码蛋白约为200个氨基酸，在多种肿瘤中存在着过度表达，并且与肿瘤的预后不良密切相关[2]。

本研究发现，TPD52在乳腺癌中的表达水平显著高于正常乳腺组织，并且在HER-2阳性乳腺癌中的表达水平显著高于HER-2阴性乳腺癌，提示TPD52可能参与了乳腺组织的癌变过程。Roslan等[9]研究表明，乳腺癌中TPD52存在表达上调，并且TPD52在HER-2阳性亚型中出现显著过度表达，TPD52的高水平与乳腺癌患者的无病生存率差密切相关，同时发现HER-2扩增的乳腺癌细胞系依赖TPD52进行存活，这提示TPD52的过度表达可能促进HER-2靶向治疗的抵抗。除此之外，与正常前列腺组织比较，TPD52在前列腺癌中的表达水平显著增高，并且其表达水平与Gleason分级和疾病进展呈正相关，具有对疾病预后预测的潜在价值[10]。与正常卵巢上皮比较，在卵巢癌所有组织学亚型中均发现存在着TPD52过度表达[11]。

TPD52在肺鳞状细胞癌中也存在表达增高，并且通过敲除TPD52基因能够使肿瘤细胞的侵袭性得到了显著抑制[12]。与正常睾丸比较，TPD52在原发性睾丸生殖细胞肿瘤中过度表达。正常睾丸中未检测到TPD52的表达，只有少部分癌前病变样本中检测到TPD52的表达，提示TPD52参与了细胞的恶变进展[13]。TPD52在结直肠癌中也出现了过表达，在转移性癌灶中检测出的TPD52水平比原发灶要显著增加，并且其高表达水平与高分期及差预后密切相关[14]。在胆管癌中也检测到了TPD52的表达增高，其高表达水平与癌组织的病理学分化程度、肿瘤分期和预后较差呈正相关[15]。国外研究者通过蛋白质组学数据进行比较分析，发现TPD52在胆囊癌中出现了表达的上调[16]。除此之外，在胶质母细胞瘤也出现了TPD52的过度表达[17]。在急性髓系白血病患者中发现存在TPD52的表达升高，并且Kaplan-Meier曲线显示TPD52过度表达与患者的预后不良密切相关[18]。同时本组结果也显示了HER-2阳性乳腺癌中TPD52的表达与淋巴结转移及高TNM分期差异有统计学意义，提示着TPD52可能增强了肿瘤的恶性程度。

此外，本研究结果显示在HER-2阳性乳腺癌中TPD52高表达组的的乳腺癌组织ki-67及Cyclin D1表达水平也显著增高。ki-67是一种肿瘤增殖蛋白，只在分裂期的细胞核中表达，Cyclin D1是一种细胞周期蛋白，推动细胞从G1期进入S期，本研究结果提示，TPD52可能通过调节细胞周期来促进肿瘤细胞的增殖。Ren等[19]研究了乳腺癌中TPD52的作用，结果显示，与对照组比较，TPD52基因敲除后的肿瘤出现了ki-67表达水平的降低，并且上调TPD52的表达促进了乳腺癌细胞系的增殖，这些提示TPD52有着促进肿瘤增殖的作用。Dasari等[20]在前列腺癌中发现，TPD52的基因扩增能够上调抗凋亡基因的表达并且下调促凋亡基因的表达，从而促进着细胞的增殖能力，并且TPD52的过表达通过增强细胞周期蛋白Cyclin D1来保护前列腺癌细胞系免受细胞凋亡。Wang等[21]研究发现，在胶质瘤细胞株中，TPD52的敲除不仅显著抑制细胞增殖和集落形成，而且在体外诱导了G0/G1细胞周期停滞。有研究者通过下调TPD52的表达水平，发现能够抑制子宫平滑肌瘤细胞的增殖，诱导细胞凋亡并且在G1期停滞[22]。国外研究显示，通过下调乳腺癌中TPD52的表达能够显著抑制细胞增殖并且诱导凋亡，从而提升乳腺癌细胞对放射治疗的敏感度[23]。Abe等[24]在口腔鳞状细胞癌中发现了TPD52的过表达，并且可促进细胞增殖及细胞死亡抵抗。此外，在胰腺癌、宫颈癌和鼻咽癌中，沉默TPD52基因的表达也能够降低癌细胞的增殖活性并且诱导其凋亡[25～27]。

综上所述，本研究证实了TPD52在HER阳性乳腺癌组织中存在显著表达上调，同时与肿瘤恶性程度升高及细胞增殖能力增强密切相关。因此，今后TPD52可能会为HER-2阳性乳腺癌患者的靶点治疗提供基础依据。