香榧瘿螨物种鉴定及防控技术研究

耿显胜，叶碧欢，张威，陈友吾，舒金平，林明

(1.中国林业科学研究院 亚热带林业研究所，浙江 杭州 311400；2.浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023）

榧树Torreya grandis是红豆杉科Taxaceae 榧树属Torreya常绿针叶树种，也是国家二级保护植物[1]。榧树自然变异类型或单株中选出的优良栽培品种香榧T.grandis‘Merrillii’是我国东南部的重要经济树种，在当地林业经济中发挥着重要作用[2-3]。香榧种子不仅富含蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸、角鲨烯、植物甾醇、生育酚、烟酸等营养物质和生物活性成分，而且风味独特、香气诱人，深受中国消费者欢迎，具有很高的经济价值[1,4-7]。香榧的种植面积和坚果年产量均不大，产品供不应求，市场价格高达120～200 元·kg-1，是目前价格最高的干果之一[2-3,8]。据统计，浙江省诸暨市赵家镇和东白湖镇每年生产香榧坚果1 000 多吨，年收入约4 亿元人民币[3,8]。目前，中国有超过5 万农民以种植香榧和生产香榧坚果作为主要的经济收入来源，香榧已成为农民发家致富的潜力树种[3,8]。

瘿螨Eriophyoidea 是植食性螨类中经济重要性仅次于叶螨Tetranychoidea 的一类害螨[9]。瘿螨不仅直接刺吸危害植物，危害造成虫瘿、毛毡、水疱、丛生、器官变色和卷曲畸形、器官脱落等症状，同时还能传播植物病毒病，造成间接危害。我国危害香榧的瘿螨最早报道于1988 年[10]，而浙江省香榧受瘿螨危害的报道最早是在2002 年[11]。目前，浙江省的各香榧产区均发现有瘿螨危害，瘿螨已成为香榧的主要害虫。瘿螨群聚于香榧叶片上吸取细胞汁液和叶绿体，轻则造成叶片失绿呈黄褐色，影响叶片的光合作用，重则引起大量落叶，甚至整株树木死亡[11-12]。如何高效地防控瘿螨，保障香榧林的健康经营，成为生产中需要解决的一个关键问题。

瘿螨由于个体小，形态结构简单，用于分类的外部形态特征少，并且有些形态特征存在同塑性进化（Homoplastic evolution）现象，这给传统的形态学鉴定带来了困难和挑战[9,13-14]。基于分子生物学的鉴定技术具有鉴定速度快、精确度高、重复性好、对样品完整性要求低等特点，已成为物种鉴定的重要方法[15-16]。而将形态学数据与分子生物学数据相结合的鉴定方法，已成为瘿螨物种鉴定最有效的方法[9,13-14,17]。本研究拟采用形态学鉴定法对香榧瘿螨进行物种鉴定，采用林间生物测定法测定了4 种杀螨剂和1 种捕食螨的防治效果，以期为香榧瘿螨的物种鉴定及高效防控提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 香榧瘿螨的形态学鉴定

2020 年6 月，于浙江省杭州市富阳区瘿螨危害的香榧林（30°2′2" N，119°42′32" E），用枝剪剪取香榧枝条，装于自封袋内，带回实验室。从枝条上剪取香榧叶片，置于VHX-5000 超景深三维显微镜下观察，初步确定叶片上存在大量的瘿螨。使用毛笔挑取叶片上的瘿螨，制备成玻片标本，用于形态学鉴定和绘图。

1.2 香榧瘿螨的系统发育分析

显微镜下使用毛笔挑取香榧叶片上的瘿螨，置于含180 μL Buffer GL 的2 mL 离心管内，每管挑30 头瘿螨，共挑3 管。依据通用型基因组提取试剂盒（TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0,TaKaRa）的方法提取基因组总DNA。

以提取的总DNA 为模板，采用3 对引物（表1）扩增28S rDNA、18S rDNA 和COI基因片段。28S rDNA和18S rDNA 基因片段PCR 扩增的反应体系为：2×PCR Mix 10 μL，10 μmol·L-1的正、反向引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，加ddH2O 补足20 μL。PCR 扩增的反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性35 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，共35 个循环；最后72 ℃延伸10 min。COI基因片段PCR 扩增的反应体系和条件参考Xue 等[18]的方法，具体的反应体系为：2×PCR Mix 12.5 μL，10 μmol·L-1的正、反向引物各1 μL，DNA 模板2 μL，加ddH2O补足25 μL。PCR 扩增的反应条件为：96 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，46 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35 个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，PCR 扩增为阳性的产物送铂尚生物技术有限公司测序。测序序列使用DNAMAN 9.0 进行多重序列比对分析，并使用NCBI（National Center for Biotechnology Information）数据库进行在线比对分析，下载与候选序列具有很高同源性的GenBank 序列。

表1 本研究使用的引物序列Table 1 Primer sequences

使用PhyloSuite v.1.2.2 软件对瘿螨总科26 个物种/凭证样本的28S rDNA-18S rDNA 序列联合构建贝叶斯系统发育树[19]，构建系统发育树时使用的外群为叶螨总科Tetranychoidea 的神泽叶螨Tetranychus kanzawai。构建系统发育树的具体方法和参数设置参见Geng 等[20]的方法和参数设置。构建好的系统发育树使用FigTree v.1.4.3及Adobe Illustrator CS6 查看和美化。

1.3 香榧瘿螨防控技术研究

1.3.1 供试药剂和捕食螨 15% 哒螨灵（广西田园生化股份有限公司），3%甲维·虱螨脲和5%阿维菌素（浙江世佳科技有限公司），21%阿维·螺螨酯（浙江永农生物科学有限公司）；加州新小绥螨Neoseiulus californicus（福建福州冠农生物科技有限公司）。

1.3.2 化学农药林间防治效果测定 2021 年10 月15 日，在浙江省衢州市衢江区选取冷杉纳氏瘿螨Nalepella abiesis危害的12 年生香榧人工林（29°07′16" N，118°58′21" E）开展林间防治效果测定。参考农药使用说明书推荐的施用浓度，用自来水将15%哒螨灵、3% 甲维·虱螨脲、5%阿维菌素和21%阿维·螺螨酯4 种化学农药分别配制成高浓度（1 500 倍、1 000 倍、1 000 倍和2 500 倍）和推荐浓度（3 000 倍、2 000 倍、2 000 倍和5 000 倍）2 个浓度梯度。采用喷雾法施药，每个处理喷雾4 株香榧，每株香榧的平均喷雾量为5 L。试验以喷雾清水为对照处理。喷雾前和喷雾后7 d，每株香榧从东南西北4 个方向各剪取1 个枝条，带回实验室。每个枝条上取新叶和老叶各1 片，在VHX-5000 显微镜下统计施药前后每片叶子上冷杉纳氏瘿螨的虫口数量，计算每个处理的虫口减退率和防治效果。虫口减退率和防治效果的计算公式如下：

1.3.3 加州新小绥螨室内和林间捕食效果测定 在室内使用培养皿搭建水阻隔平台，进行加州新小绥螨室内捕食实验。采集冷杉纳氏瘿螨危害的香榧叶片，在显微镜下统计叶片上瘿螨的数量，之后将叶片放置于培养皿中，接入加州新小绥螨，实验共用9 片香榧叶片。接螨后的水阻隔平台放置于人工气候箱内。人工气候箱的设置为：温度25℃，相对湿度85%，光照强度2 000 lx，光周期12D:12L。48 h 后统计香榧叶片上的冷杉纳氏瘿螨数量，计算捕食率。捕食率的计算公式如下：

捕食率=被捕食的瘿螨数量÷瘿螨总数×100%

2021 年10 月15 日，在浙江省衢州市衢江区选取冷杉纳氏瘿螨危害的12 年生香榧人工林开展林间防治效果测定。每株香榧树上挂5 袋加州新小绥螨（3 000 头·袋-1），实验重复4 次。释放捕食螨前和7 d 之后，每株香榧从东南西北4 个方向各剪取1 个枝条，带回实验室。依据1.3.2 的方法统计叶片上害螨的虫口数量，使用1.3.2 的公式计算虫口减退率和防治效果。

1.4 数据处理

获得的实验数据使用Excel 2010 和SPSS 23.0 进行分析处理。使用SPSS 23.0 对数据进行描述性统计、方差齐性检验和方差分析。方差分析时，需要对虫口减退率和防治效果的原始数据做反正旋转换。

2 结果与分析

2.1 香榧瘿螨的形态学鉴定

室内显微观察发现，香榧叶片上存在大量的瘿螨。瘿螨的卵和若虫存在于叶片的背面，成虫活动能力强于若虫，主要存在于叶片的背面，但腹面也有分布。瘿螨使用刺吸式口器吸食香榧叶片的汁液和叶绿体，造成受害部位初期呈白色失绿状，后期呈黄褐色。大量瘿螨聚集在香榧叶片上危害，轻则造成叶片发黄且失去光泽，严重者引起叶片脱落，甚至整株树木死亡。

经形态学鉴定，危害香榧的瘿螨为冷杉纳氏瘿螨。该瘿螨隶属于植羽瘿螨科Phytoptidae 纳氏瘿螨属Nalepella。冷杉纳氏瘿螨的主要鉴别特征为：体纺锤形；喙斜下伸，口针略弯曲；须肢端部平截，须肢背膝节刚毛不分叉；背盾板具前叶突，背瘤发达，圆柱形，背毛3 根，包括1 根短的内顶毛和2 根长的背毛；足6 节，具模式刚毛，羽状爪完整，9 支，爪端球明显，足I 胫节上具小刺，基节刚毛3 对；大体无亚背毛，腹刚毛俱全，如图1。

图1 冷杉纳氏瘿螨成螨的形态特征Figure 1 The morphological characteristics of adult N.abiesis

2.2 香榧瘿螨的系统发育分析

PCR 扩增结果表明，3 对引物都能够扩增出特异性条带，并且扩增条带的大小与预期大小一致（图2），初步确定3 对引物能够特异性扩增出瘿螨的28S rDNA、18S rDNA 和COI基因片段。对扩增产物进行测序和序列分析，得到瘿螨28S rDNA的460 bp 序列、18S rDNA 的807 bp 序列和COI基因的658 bp序列。

图2 PCR 扩增冷杉纳氏瘿螨28S rDNA、18S rDNA 和COI 基因片段Figure 2 PCR amplification of 28S rDNA,18S rDNA,and COI fragment from genomic DNA extracted from N.abiesis on T.grandis ‘Merrillii’

DNAMAN 9.0 多重序列比对结果表明，3 个样品间18S rDNA 的同源性为99.75%，而3 个样品间28S rDNA和COI 基因片段的同源性为100%。测序序列经NCBI 数据库比对，未在GenBank 中找到同源性很高的瘿螨物种序列。本研究获取了冷杉纳氏瘿螨28S rDNA、18S rDNA 和COI基因序列，将这些序列提交到GenBank（登录号分别为：OM701792、OM717253 和OM692372）。

使用瘿螨总科26 个物种/凭证样本的28S rDNA-18S rDNA 串联序列采用贝叶斯推断法构建系统发育树，建树时28S rDNA 和18S rDNA 使用的核苷酸替换模型都是GTR+I+G。从贝叶斯系统发育树的拓扑结构可以看出，26 个瘿螨总科的物种/凭证样本分成3 个分支，本研究的冷杉纳氏瘿螨与三毛瘿螨属Trisetacus、纳氏瘿螨属Nalepella、博氏瘿螨属Boczekella和Setoptus属的7 个物种/凭证样本形成Clade I 分支，该分支所有物种/凭证样本都属于植羽瘿螨科，表明这4 个属间的亲缘关系很近（图3）。分析Clade I 包含物种的寄主植物，所有8个瘿螨物种/凭证样本的寄主植物都是裸子植物门的针叶树种，表明寄生在亲缘关系近的寄主植物上的瘿螨物种也具有较近的亲缘关系。Clade II 分支包含瘿螨科Eriophyidae 和羽爪瘿螨科Diptilomiopidae 的16 个物种/凭证样本，表明瘿螨科和羽爪瘿螨科物种间的亲缘关系很近（图3）。Clade III 分支包含植羽瘿螨科的2 个物种，这2 个物种都采集于俄罗斯，并且其寄主均为草本的莎草科Cyperaceae 植物（图3）。

图3 基于28S rDNA 和18S rDNA 序列联合构建的贝叶斯系统发育树Figure 3 Bayesian inference phytogenic tree based on 28S rDNA and 18S rDNA sequences

2.3 冷杉纳氏瘿螨防控技术研究

经室内显微观察，浙江省衢州市衢江区实验林的香榧叶片上也存在大量的冷杉纳氏瘿螨（图4）。由表2 可知，防治前其虫口密度在16.84～30.84 头·片叶-1，防治后其虫口密度降低到3.41～18.31 头·片叶-1。施药和释放加州新小绥螨后冷杉纳氏瘿螨虫口密度和虫口减退率的方差分析结果表明，不同处理间差异显著（P＜0.05）。所有9 种处理与对照处理间的差异都达到显著水平（P＜0.05），表明所有的处理均能显著降低香榧叶片上瘿螨的虫口密度。高浓度和推荐浓度的15%哒螨灵、5%阿维菌素和21% 阿维·螺螨酯施用后，各处理的虫口密度差异均不显著（P＞0.05）（表2），表明这3种农药在推荐浓度下即可明显降低香榧叶片上的瘿螨的虫口密度；施用高浓度（1 000 倍）和推荐浓度的3% 甲维·虱螨脲后，虫口密度差异显著（P＜0.05）（表2），表明该药剂在高浓度时对香榧叶片上瘿螨的虫口密度的降低作用更明显。

图4 香榧叶片上的冷杉纳氏瘿螨Figure 4 N.abiesis on T.grandis ‘Merrillii’ leaf

防治效果表明，9 种处理的防治效果在55.93%～88.70%（表2），其中21%阿维·螺螨酯和15% 哒螨灵在推荐浓度下的防治效果在87.00%以上，高于5%阿维菌素和3%甲维·虱螨脲的防治效果，也显著高于（P＜0.05）捕食螨的防治效果。因此，21%阿维·螺螨酯和15%哒螨灵对冷杉纳氏瘿螨的防治效果更好。

表2 施药和释放天敌前后香榧叶片上冷杉纳氏瘿螨的虫口密度和防治效果Table 2 Population density of N.abiesis on T.grandis ‘Merrillii’ leaves before and after chemical control and natural enemy release

室内捕食螨的捕食效果表明，加州新小绥螨对冷杉纳氏瘿螨的卵、若螨和成螨均具有捕食功能，加州新小绥螨对9 张叶片上瘿螨的捕食率为95.45%～100%。林间释放加州新小绥螨时，其虫口减退率和防治食效果仅为26.25%和55.93%，低于室内测定结果，也低于4 种化学农药的林间测定结果。很有可能是香榧叶片上冷杉纳氏瘿螨的虫口密度太大，释放加州新小绥螨难以捕食掉所有的害螨。因此，生产中应将捕食螨与化学农药联合使用，先施用21%阿维·螺螨酯或15%哒螨灵，将虫口密度降低下来，然后再释放加州新小绥螨。

3 结论与讨论

本研究采用形态学结合分子生物学的方法对香榧瘿螨进行物种鉴定，明确了危害香榧的瘿螨为冷杉纳氏瘿螨，研究结果可为冷杉纳氏瘿螨的快速鉴定提供参考。系统发育分析表明，冷杉纳氏瘿螨与三毛瘿螨属、纳氏瘿螨属、博氏瘿螨属和Setoptus属的7 个物种/凭证样本间亲缘关系近，而所有8 个瘿螨物种/凭证样本的寄主植物都是裸子植物门Gymnospermae 的针叶树种，揭示瘿螨物种的进化与寄主植物相关联。

香榧是一种寿命很长的四季常绿的针叶树种[2]，长寿命和冬季不落叶的特性为冷杉纳氏瘿螨的寄生提供了稳定的环境条件。冷杉纳氏瘿螨个体微小，人眼难以观察到，加上早期的危害症状不明显，这为冷杉纳氏瘿螨通过种苗或嫁接繁殖体远距离传播和扩散创造了条件。自2002 年首次在浙江省发现冷杉纳氏瘿螨危害以来，该害螨在浙江省迅速扩散和蔓延。目前，浙江省的绝大多数种植区的香榧都遭受瘿螨的危害。瘿螨危害致使香榧叶片失绿，严重者叶片大量脱落，甚至整株死亡[11,17]。如何高效地防控冷杉纳氏瘿螨，成为生产中需要解决的一个关键问题。本研究通过林间生物测定法，测定了4 种杀螨剂和1 种捕食螨在林间的防治效果。4 种化学农药中，21%阿维·螺螨酯和15%哒螨灵在推荐浓度下的防治效果均超过87.00%，高于另外2 种化学农药。因此，21%阿维·螺螨酯和15%哒螨灵的防治效果更好。生产中可以将这2 种化学农药交替使用，防止冷杉纳氏瘿螨产生抗药性。另外，本研究选择在香榧果实采收后施药，避免了化学农药对香榧果实的污染，保障了可食用林产品的品质。

加州新小绥螨对冷杉纳氏瘿螨的卵、若螨和成螨均具有捕食功能，其在林间的防治效果为55.93%。生产中应将加州新小绥螨与化学农药联合使用，先施用化学农药降低冷杉纳氏瘿螨的虫口密度，然后再释放加州新小绥螨，利用捕食螨主动搜寻猎物的功能，将叶片上残存的害螨清除掉，从而达到高效防控冷杉纳氏瘿螨的目的。

致谢：本研究中瘿螨物种的形态学鉴定得到广西大学王国全教授和贵州大学乙天慈教授的帮助，谨此致谢。