基于环境DNA方法的北京雁栖湖鱼类调查

文/高婉茹 李雪健 席蕊 邢迎春* 赵亚辉

环境DNA（Environmental DNA，eDNA）指从土壤、水、冰川或沉积物等环境样品中提取的DNA，可揭示过去和现今生物多样性信息。eDNA发展初期主要用于对单一物种分布范围和生物量的研究，随着DNA宏条形码和高通量测序技术的发展，该方法已被应用到河流、水库和湖泊等水体的鱼类调查中。传统的鱼类监测往往依赖于网捕、电鱼和诱捕等方法采集鱼类样品，利用形态学进行物种鉴定，这在一定程度上给鱼类资源带来伤害，并对研究人员的分类学专业知识要求较高。eDNA方法是通过提取环境样品中的DNA，利用特定引物对目标片段进行扩增，并利用高通量测序获得的目标片段序列进行鱼类物种鉴定。与传统方法相比，具有非接触性采样、灵敏度高、检出率高、成本较低和对生态环境破坏性较小等优势。湖泊相对于河流，流速更缓，其中的生物痕量DNA富集量更高，故更适合利用eDNA开展鱼类检测。

雁栖湖（又名北台上水库）是北京市雁栖湖生态发展示范区的核心区，2014年APEC会议和2017年“一带一路”国际合作高峰论坛相继在雁栖湖召开，使得雁栖湖具有较高的国际知名度。雁栖湖由东、西两个湖（库）区构成，水面面积2.3km，总容量为3830万m，了解其鱼类组成现状有助于维持湖区水生生态，不仅对提升水体健康程度有重要意义，也有利于维护雁栖湖的知名度。目前，关于雁栖湖鱼类的系统调查较少，同时受限于库区管理要求和渔法限制，传统调查方法恐很难完整呈现湖区鱼类面貌。因此作者采取eDNA方法，结合以往积累的工作经验，对雁栖湖鱼类组成进行调查，并依据eDNA可取代物种数量，对鱼类丰富度进行评估。

一、材料与方法

（一）水样品采集

分别于2021年4月和7月，在雁栖湖东、西湖区各选取9个和2个采样点进行水样品采集，采样点布设见图1。在每个采样点，使用采水器在水深1m处采集1L水样品，重复采集3个样品，共采集66个水样品，低温避光保存。为尽可能减少污染，在采样前使用10%漂白剂对船只和采样工具进行清洁消毒，实验操作人员在采样过程中严格佩戴口罩和一次性手套，并在不同采样点之间更换手套。

图1 雁栖湖采样点布设图

（二）方法

对采集后的水样品进行eDNA富集、DNA提取、PCR扩增和高通量测序与数据分析等操作。使用直径47mm、孔径0.45μm的混合纤维素酯膜对水样品进行真空抽滤。将滤膜保存至2mL灭菌离心管，-10℃低温冷冻保存。使用DNeasy Blood and Tissue DNA Extraction Kit试剂盒提取eDNA，并根据Renshaw提出的方法对试剂盒提供的DNA提取方案进行改进。使用分光光度计对提取的DNA样品浓度进行测定，保存于-20℃。

使用鱼类线粒体1 2 S r R N A通用引物（正向序列：5’-A A A C T C G T G C C A G C C A C C-3’；反向序列：5’-GGGTATCTAATCCCAGTTTG-3’）进行PCR扩增，目标片段长度为160bp～180bp。将纯化后的PCR产物进行定量，根据浓度进行等量混合，获得浓度不低于20ng/μL的PCR产物混合物。将其送至北京华大基因科技有限公司进行建库和后续高通量测序，采用Illumina Novaseq高通量测序平台进行PE150双端测序。原始测序数据的生物信息学分析在Ubuntu操作环境下运行，使用Qiime2（版本2021.4）软件对原始测序数据进行序列拆分、拼接、去重和分子可操作分类单元（Molecular Operational Taxonomic Units，MOTUs）聚类等操作，以获得MOTUs表。使用NCBI-BLAST软件，将序列数≥10的MOTUs与NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中辐鳍鱼纲序列进行比对，完成物种注释。

二、结果

（一）eDNA测序结果

雁栖湖eDNA样品高通量测序获得原始序列34.2G，序列数量为92668000条。经点位拆分，共保留序列33145258条。对正反向序列进行拼接和筛选，共保留序列14044492条，保留长度为160bp～180bp的序列并去除嵌合体，共获得有效序列13989807条，每一个样品的有效序列范围为275614条～1320099条。按照100%聚类并保留≥10条序列数的MOTUs，共获得1014个MOTUs。将匹配到同一物种的MOTUs序列进行合并，共保留26个鱼类MOTUs，其中阴性对照中未检测到任何物种。

（二）基于eDNA的鱼类物种组成

基于eDNA共检测到鱼类26种，隶属于5目8科25属（见表1）。其中土著鱼类23种，占鱼类物种总数的88.46%，隶属于4目7科22属；其他3种为外来物种，占总数的11.54%，包括大鳞副泥鳅、池沼公鱼和河川沙塘鳢。从不同采样点的鱼类物种数量来看，1号、7号和11号采样点的物种数最多，各24种，占检测到物种总数的92.31%；其次是4号和10号采样点，各检测到21种，占检测到物种总数的80.77%。所有采样点检测到的物种数量均超过总物种数的50%。从不同季节看，雁栖湖春季调查到鱼类24种，隶属于4目7科23属；夏季调查到20种，隶属于5目8科20属。春、夏季均调查到的鱼类共18种；仅于春季检测到的鱼类有6种，包括达氏红鳍鲌、鳙、拉氏大吻鱥、东北颌须鮈、小黄黝鱼和花鳅科sp.；仅夏季检测到的鱼类有2种，包括大鳞副泥鳅和青鳉。春季除3号、4号和5号采样点外，其他采样点检测到的物种数均高于夏季。雁栖湖春、夏季所有采样点均检测到的鱼类共9种，包括鲤、鲫、草鱼、麦穗鱼、红鳍原鲌、鲢、宽鳍鱲、马口鱼和池沼公鱼。

表1 雁栖湖鱼类物种名录

（三）鱼类生态类型

根据生态习性，雁栖湖主要以定居型鱼类为主。根据体型大小分析，小型鱼类最多，为21种，占物种总数的80.77%；大型鱼类共5种，占19.23%。根据栖息水层分析，雁栖湖内中上层鱼类最多，共10种，占物种总数的38.46%；其次是中下层鱼类，共9种，占34.62%；底层鱼类最少，共7种，占26.92%。根据摄食类型分析，杂食性鱼类最多，共15种，占57.69%；其次是肉食性鱼类10种，占38.46%；植食性鱼类最少，仅1种。

（四）eDNA相对序列丰度

通过比较各鱼类物种的eDNA序列相对丰度，池沼公鱼的相对序列丰度最高，达34.12%；其次是鲫和鲤，分别占25.72%和15.22%，其他鱼类均低于10%，这三种鱼类在所有采样点均被检测到。根据春、夏季各物种eDNA相对序列丰度结果，春季鱼类序列相对丰度超过10%的物种包括池沼公鱼（36.27%）、鲤（24.26%）、鲫（20.69%）和鲢（11.17%）；夏季鱼类序列相对丰度超过10%的物种包括鲫（32.16%）、池沼公鱼（31.35%）和子陵吻虾虎鱼（17.13%）。根据雁栖湖春、夏季各采样点鱼类物种序列相对丰度（见图2），11号采样点是春、

图2 雁栖湖春、夏季各采样点鱼类物种序列相对丰度

夏两季鱼类组成变化最明显的样点，春季以池沼公鱼为主，夏季以子陵吻虾虎鱼为主。

三、分析与讨论

（一）雁栖湖鱼类组成分析

基于eDNA方法，雁栖湖鱼类以鲤形目鲤科为主。从鱼类区系组成看，目级水平上，鲤形目共19种，占鱼类物种总数的73.08%；其次是鲈形目3种，占11.54%；鲇形目2种，占7.69%；颌针鱼目和胡瓜鱼目物种数量最少，各包括1种，分别占3.85%（见图3a）。科级水平上，鲤科鱼类物种数最多，共17种，占总物种数的65.38%；其次是沙塘鳢科和花鳅科各2种，分别占7.69%；青鳉科、胡瓜鱼科、虾虎鱼科、鲇科和鲿科各1种，分别占3.85%（见图3b）。

图3 雁栖湖目级和科级水平鱼类物种组成（a.目级水平；b.科级水平）

雁栖湖属于海河水系潮白河流域，历史上在潮白河流域自然分布的土著鱼类约有48种，现状调查尚可发现39种，本研究调查到的雁栖湖土著鱼类占到潮白河流域的58.97%。一些主要分布于山区溪流生境的种类未在雁栖湖发现，例如唇䱻、花䱻、棒花鮈等，这与雁栖湖典型的水库静水生境有很大关系，因此，红鳍原鲌、达氏红鳍鲌、鲢、鳙、䱗等成为雁栖湖鱼类组成的主体。与地理位置且水体环境较近的怀柔水库相比，鱼类物种数量较为接近，在两个水库均有分布的物种共18种。

根据本研究的调查结果，雁栖湖共有3种外来鱼类。大鳞副泥鳅和池沼公鱼为发展渔业养殖引进的。根据相关记录，湖区在1985年即从日本引进池沼公鱼推广养殖，根据优势种分析，池沼公鱼在雁栖湖已广泛分布且生物量较高，该物种在所有采样点均被检测到，其中8个采样点春、夏季序列相对丰度均超过20%。池沼公鱼会吞食土著鱼类的鱼卵，导致土著鱼类数量下降，甚至可能会导致一些鱼类濒临灭绝。河川沙塘鳢原产于长江中下游地区，约2009年在北京发现，2013年以前其在北京地区为偶见种，种群数量稀少，然而近年来该物种已在北京多个水体暴发，本研究在8个采样点均检测到，说明其目前也是雁栖湖的主要外来鱼类之一。河川沙塘鳢为肉食性鱼类，其在雁栖湖的广泛分布可能对同水域分布的小型鱼类等具有巨大威胁。

（二）基于eDNA的雁栖湖鱼类季节性差异

根据本研究结果，春季检测到的鱼类数量略高于夏季。对春、夏两季的鱼类丰富度进行比较，雁栖湖超80%的采样点物种丰富度表现为春季高于夏季，这与春季多为鱼类的繁殖期有关，即春季鱼类因为繁殖需要，往往产生聚群现象，因此检测到的鱼类数量更多。

（三）eDNA方法可以作为雁栖湖鱼类多样性长期监测的首选方案

鱼类传统调查需依赖网捕或电鱼等方式，在北京等地愈加严格的禁渔措施下，采用传统方式进行鱼类多样性调查的难度不断增加，很难使用拖网和电鱼等对生境破坏性较大的方式进行调查，且鱼类物种的形态学鉴定往往依赖于科研人员的分类学经验和水平。本研究团队近两年在雁栖湖利用地笼进行调查，仅捕获到8种鱼类，明显低于利用eDNA方法。一些体型较大的鱼类，如草鱼、鲢等则需要采用大型网具才能捕获。从调查所得物种数量来看，两种调查方法的优势种都包括鲫和池沼公鱼，这也反映了本研究基于序列丰度进行的优势种筛选结果具有一定的可信度和准确性。因此eDNA方法可以作为类似水体进行长期鱼类监测的首选方法。

eDNA参考数据库是保证eDNA监测结果质量的关键因素之一，仅依赖于NCBI （National Center for Biotechnology Information）参考数据库会导致部分本地物种无法识别，目前迫切需要建立北京乃至海河流域鱼类eDNA参考序列数据库，一方面可以提高鱼类物种鉴定的准确性，另一方面也为eDNA方法的推广提供基础。