云南玉溪部分地区鸽子血变原虫分子鉴定及进化分析

董仙兰，万宝云，李红霞，杜娟娟，杨秋楠，徐 聪*

(云南农业大学动物医学院，云南昆明 650201；2.云南省玉溪市易门县农业局，云南玉溪 651100；3.云南省玉溪市动物疫病预防控制中心，云南玉溪 653100)

血变原虫属(Haemoproteus)主要寄生在鸟类红细胞内，已在72个科的鸟类中发现超过140种鸟类血变原虫[1-2]。在亚洲、欧洲、南美洲、北美洲和非洲的许多动物园都有相关报道[3-6]。国内记载鸟类血变原虫的文献中,明确种类的仅有鸽血变原虫[7]。1989年我国首次报道福建厦门家鸽感染鸽血变原虫(Haemoproteuscolumbae)，并阐述了鸽血变原虫(H.columbae)的生活史，证明虱蝇是其传播媒介，主要流行于温带和热带地区[8]。血变原虫对鸟类健康影响大。鸽感染后会导致鸽贫血、厌食、体重下降、精神沉郁、跛行、呼吸困难和突然死亡，又被称为鸽疟疾。感染的鸽子均处于慢性感染阶段，影响家鸽健康[9]。宿主的身体状况与感染强度呈负相关[10]。本研究旨在对鸽血变原虫进行分子流行情况调查，为鸽血变原虫的防控提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 采集云南玉溪研和地区2个鸽子养殖场的血液样品324份,用EDTA-2K抗凝管采集，置于4℃冰箱保存备用。

1.1.2 主要试剂 血液DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司产品；2×TaqPCR Master Mix酶，生工生物工程(上海)股份有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 恒温水浴箱，深华生物技术有限公司产品；高速台式离心机，Wise Spin公司产品；PCR仪，Bibby Scientific公司产品；水平电泳仪，BAYGENE公司产品；凝胶成像系统，大韩科学仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 血变原虫cytb基因扩增 根据文献[11]中cytb基因特异套式PCR引物对所有样品进行检测，目的片段大小约为500 bp(表1)。

1.2.2 DNA提取与套式PCR检测 参照血液DNA提取试剂盒说明书提取DNA，并进行套式PCR扩增。第1轮反应体系为：ddH2O 11 μL,2×TaqPCR Master Mix酶11 μL,引物各0.5 μL，模板2 μL，反应总体积为25 μL。反应条件为：94℃ 3 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 45 s，25个循环；72℃延伸10 min。第2轮反应体系同第1轮，反应条件为：94℃ 3 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 45 s，35个循环；72℃延伸10 min。同时设立阴、阳性对照。

1.2.3 测序分析 取4 μL PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳约30 min后，于紫外分析仪中观察，阳性条带对应的PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果用SeqMan5.01拼接，拼接序列提交至NCBI中获得序列登录号，并在Blast在线比对，下载GenBank中公布的鸽血变原虫相关序列，用邻接法(N-J)在MEGA6.0软件中构建系统进化树，确定虫株种属关系。

表1 cytb基因的引物序列

2 结果

2.1 电泳结果

324份血液样品中检出12份阳性，阳性率为3.70%(图1),500 bp左右的条带即为目的条带。

M.DNA标准DL 2 000；1～8.样品；-.阴性对照；+.阳性对照

2.2 序列比对结果

12份阳性样品测序，将拼接结果在NCBI的Blast上进行比对分析，发现12份样品中7份样品序列与伊朗地区的鸽血变原虫(H.columbae)相似性为98.67%～99.60%，5份与巴西地区的鸽血变原虫(H.columbae)序列相似性达99.42%(表2)，同时测序结果用SeqMan5.01拼接，拼接序列提交至NCBI中获得序列登录号为MT576132-43。

2.3 进化分析结果

用MEGA6.0软件N-J法构建基因进化树，发现鸽子感染的血变原虫的种类比较单一，都是鸽血变原虫(H.columbae)(图2)，图2中▲表示试验样本。试验样品与血变原虫置信度为100%，与鸽血变原虫位于同一分支，表明玉溪地区鸽子感染了鸽血变原虫。

表2样本cytb基因序列在NCBI-BLAST中相似性比较结果

3 讨论

规模化饲养肉鸽是我国近几年来发展起来的一种养殖业，云南玉溪是养殖鸽子存栏量较多的地区，鸽存栏量大概在12万只左右，养殖过程中，重点关注的寄生虫病是毛滴虫病[12]，血变原虫病关注较少。直到云南玉溪的某养鸽场发生了鸽子死亡才引起重视。结合该病的传播媒介虱蝇在该养殖场的流行情况，经初步诊断，推测可能为血液原虫病。据此，采集了鸽子血液样本，对血变原虫的cytb基因进行特异性套式PCR检测，结果表明玉溪地区鸽感染的血变原虫为鸽血变原虫。样品与血变原虫以100%的置信度位于同一大分支，与已报道的博茨瓦特、巴西、哥伦比亚、美国、南非等国家的鸽血变原虫位于同一分支，表明是同一种群。

本试验采集的324份血液样品中检出12份阳性，阳性率为3.70%，鸽血变原虫的感染率相对较低，可能与各地区间的气候条件、虱蝇等中间宿主的流行情况及饲养管理差异有关。同时也可能与养殖场的选址及饲养管理较好有关，鸽血变原虫病不仅会对养殖业造成重大的经济损失，该病的中间宿主虱蝇等也会对人类健康构成严重威胁。因此，加强玉溪乃至整个云南省鸽子饲养管理中血变原虫及中间宿主虱蝇的防控十分重要。

图2血变原虫cytb基因进化树(N-J)