水稻耐旱性及其研究进展

马孝松,曾贤军,李恩熙,梅捍卫,罗利军,刘鸿艳

(农业农村部粮食作物基因资源评价利用重点实验室,上海市农业生物基因中心,上海 201106)

气候变化是21世纪中国乃至全球农业面临的严峻挑战之一,事关粮食安全、社会稳定和经济发展。近年来,全球气候变暖,干旱、高温等自然灾害频发,对农业生产造成了严重的威胁。水稻是我国最重要的粮食作物,同时也是用水大户,水稻用水量约占总用水量的50%[1]。我国是世界上13个贫水国家之一,人均淡水资源占有量为2 400 m3,仅为世界人均淡水资源占有量的1∕4。我国水稻生产正面临着水资源短缺的危机,发掘水稻耐旱资源和耐旱基因,解析耐旱机制,推进水稻耐旱性科学理论的发展,培育具有耐旱性的水稻品种具有重要的科学意义和应用价值[2]。本文就水稻耐旱性的基本定义、耐旱性鉴定方法和评价指标以及耐旱性分子遗传研究进展进行综述,以期进一步认识水稻耐旱性,为指导水稻耐旱性基础研究和新品种选育提供理论参考。

1 耐旱性的基本定义

抗旱性是作物与干旱环境相互作用的复杂数量性状。在自然界中,作物已经进行了一系列形态、生理和生化方面的进化来应对干旱胁迫。抗旱性(Drought resistance,DR)是一个广义的术语,主要包括逃旱性(Drought escape,DE)、避旱性(Drought avoidance,DA)、耐旱性(Drought tolerance,DT)和复原抗旱性(Drought recovery)[2]。从农业生产的角度而言,作物的抗旱性指干旱胁迫条件下相对于正常水分条件下的生物量或经济产量,通常以两种条件下的比值来表示,如相对鲜重或干重、相对产量或结实率等。目前广受关注的是避旱性和耐旱性这两种抗旱机制[2]。避旱性是作物在土壤含水量减少的情况下保持相对较高水势的能力,主要依靠发达的根系从深层土壤中吸收水分或减少干旱胁迫下的蒸腾来实现。耐旱性指作物耐受低水势并维持一定水平生理活动和生长发育的能力,主要通过增加细胞内渗透调节物质来维持细胞膨压,并通过调节细胞防御酶的活性减少有害物质的积累。

2 水稻耐旱性的鉴定方法

2.1 干旱处理方法

干旱可能发生在水稻发育的各时期,较好的萌芽期和苗期耐旱性有利于进行旱直播并可提高成苗率,而分蘖期、孕穗期、开花期和灌浆期的耐旱程度则对产量有较大影响。其中,孕穗期对干旱最为敏感,苗期进行抗旱性鉴定较为方便,因此这两个时期的植株耐旱性最为研究人员所关注。

聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)模拟干旱胁迫处理是研究萌芽期和苗期耐旱性常用的方法,通常在实验室光照培养箱或人工气候室进行。高分子量的聚乙二醇(PEG4000—8000)不易被植物吸收,可以改变营养液的渗透势,引起植物水分亏缺[3]。通常在3叶期后,用15%—20%的聚乙二醇(PEG)溶液模拟干旱胁迫,也有利用育苗盘或托盘进行苗期土壤干旱胁迫或反复干旱胁迫[4]。

通常,在避雨棚内采用盆栽法于分糵期及以后的生长发育时期进行耐旱性鉴定。水稻根系的主要分布范围在土层深度30 cm以内。在盆栽试验中,水稻避旱特性难以发挥,呈现的是其耐旱性。笔者采用70 cm的深盆进行避旱性和耐旱性的鉴别试验,土壤深度为60 cm,盆底侧边开洞并用橡胶塞堵塞洞口。干旱处理时拔除橡胶塞,一方面可加快排除土壤水分,另一方面也可避免盆底积水。在此试验条件下,参试材料中深根比较小的水稻品种‘Blue Belle’能积累更多的脯氨酸,具有更高的过氧化物酶(POD)活性和超氧化物歧化酶(SOD)抑制率,表现典型的耐旱生理特性[5]。

盆栽试验有一定的局限性,一是盆与盆之间干旱胁迫程度差异可能较大,尤其当植株个体生物量差异较大时;二是盆栽小环境与大田环境存在较大差异。因此,大田耐旱性鉴定非常有必要。在田间开展耐旱性研究需要阻断深根吸水途径,让避旱性保持“中立”[6]。因此,一般在有犁底层的水田进行大田耐旱性鉴定,并配备防雨设施,如固定或活动的挡雨棚等。

“薄膜隔断浅土层鉴定法”(图1)[7]能更好地规避避旱性的影响,可在大田进行水稻耐旱性鉴定。此方法设计了一个专用的鉴定设施,包括一个棚顶及四周可以开闭的避雨大棚;将大棚内田块开挖到30 cm深度并在该土层底部和四周铺设隔离薄膜(0.15 mm,三层);再将土壤回填至土层深度为30 cm。利用该方法先后对水稻微核心种质和抗旱核心种质、重组自交系群体等进行了耐旱性鉴定,发现具有深根特性的旱稻品种‘IRAT109’的耐旱系数(旱田产量∕水田产量)仅为0.21,表明其耐旱性较差;而另外一个具有深根特性的品种‘IAC1246’的耐旱性系数为0.74,耐旱性较好。目前在上海市农业科学院青浦白鹤基地和上海市农业生物基因中心金山廊下基地均建有水稻耐旱性鉴定评价设施,可以满足近千份水稻种质资源的耐旱性评价。

2.2 耐旱性指标

2.2.1 生理指标

水稻耐旱性相关的生理指标主要有渗透调节物质含量、抗氧化酶类活性和非酶类物质含量。

渗透调节是细胞水势降低时,可溶性物质在细胞中积累以降低细胞渗透势,维持细胞膨压的过程。在干旱胁迫条件下,渗透调节受气孔导度、光合作用、叶片含水量以及细胞生长影响。研究发现,干旱条件下水稻中游离氨基酸,特别是脯氨酸、可溶性糖等有机小分子溶质和无机离子大量积累[2]。

脯氨酸是最大的水溶性氨基酸,在植物响应干旱胁迫过程中起着非常重要的作用。提高脯氨酸含量可以降低叶水势,提高植物对干旱和盐胁迫的耐受性[8-9]。此外,脯氨酸还是细胞膜完整性的重要保护剂、干旱条件下重要的羟基自由基清除剂[10]。干旱条件下积累的可溶性糖主要有葡萄糖、果糖、蔗糖等。这些可溶性糖参与渗透调节,并在维持植物蛋白稳定方面起重要作用。此外,植物糖与逆境激素脱落酸(ABA)有关联,参与调控植物非生物抗性[11]。晚期胚胎丰富蛋白(LEAs)是超亲水蛋白,能在干旱胁迫环境中保护生物大分子,减轻水分胁迫对植物的伤害。细胞内的水孔蛋白主要分布在原生质膜和液泡膜上,具有促进和调节水分跨膜运输的功能,可调控细胞膜上的水通道,选择性的平衡水分进出细胞[12-13]。

在干旱胁迫过程中,植物体内会产生大量的活性氧物质,如超氧阴离子()、过氧化氢(H2O2)、羟基自由基(·OH)、单线态氧(1O2)等。活性氧的积累会对细胞成分造成氧化损伤,如破坏脂质和蛋白结构、DNA片段化、抑制酶活性、激活程序性细胞死亡途径,导致细胞死亡等[14]。植物也进化出一套抗氧化保护系统来清除活性氧,维持细胞膜稳定性[14],这套活性氧清除保护系统主要由酶促清除系统和非酶促清除系统组成。酶促清除系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)等抗氧化酶类。干旱发生时,细胞内活性氧清除酶的活性及非酶类抗氧化物含量增加。在水稻中已知的耐旱基因OsPP18是依靠活性氧清除系统来提高耐旱性和抗氧化能力的典型例子[15];水稻DST基因也是通过调控过氧化氢(H2O2)含量影响气孔开闭,实现对耐旱性和耐盐性的调控[16]。非酶促清除系统包括抗坏血酸、谷胱甘肽等非酶类抗氧化物质。有研究表明,以抗坏血酸为种子引发剂可以提高小麦的抗旱性[17]。在拟南芥中增强EsWAX1基因的表达,可以提高表皮蜡质层和抗坏血酸含量,从而提高转基因植株耐旱性[18]。在烟草和柱花草中共表达NCED和ALO两个基因可以极显著提高抗坏血酸的含量,进而增强植株对干旱和低温的耐性[19]。笔者在水稻耐旱性的转录组学研究中发现,耐旱品种的差异基因被显著富集在谷胱甘肽代谢、黄酮和类黄酮代谢、抗坏血酸代谢、类胡萝卜素代谢等抗氧化相关代谢途径,而敏感品种中差异基因则不能被显著富集到这些抗氧化相关代谢途径中[7]。

多胺是植物体内具有生物活性的低分子量脂肪族含氮碱,最常见的有腐胺、亚精胺和精胺,参与调节植物的生长发育和形态建成[20]。研究发现,水稻抗旱品种多胺的积累时间较早且持续时间较长[21]。亚精胺和精胺有稳定膜结构、保护DNA和蛋白质、清除超氧自由基的作用。水稻中的OsHSFA3基因通过调控多胺的合成提高耐旱性[22]。

2.2.2 发育和形态指标

芽期耐旱性鉴定指标主要包括发芽率和发芽势。发芽率指测试种子发芽数占测试种子总数的百分比。发芽势即种子从发芽开始到发芽高峰时段内发芽种子数占测试种子总数的百分比,可以反映测试种子的发芽速度和整齐度。

干旱胁迫下水稻的发育会受到不同程度抑制,出现叶片变小、株高降低、分糵减少、生育期延迟、生物量和产量减少等症状。苗期耐旱性鉴定的指标主要有根长、株高、生物量、存活率等。存活率一般于15—20 d的干旱胁迫后复水3—5 d时统计。分蘖期及生殖生长时期的耐旱性鉴定指标主要有叶面积、卷叶级别、叶片枯死率、分糵数、株高、生物量、生育期延迟天数等[23]。Zu等[24]对13个旱稻品种进行耐旱性鉴定,测量倒1、2、3叶的枯死部分长度和全叶长,利用两者比值来判断品种的耐旱性。叶片绿叶率也可以反映耐旱性,但要量化测定难度较大。本实验室对55份水稻资源进行苗期PEG6000模拟干旱胁迫,分别从前视图和俯视面进行RGB成像,利用机器视觉技术判读图片中的绿叶面积和枯死叶面积,发现前视图和俯视面绿叶率与绿叶鲜重占比呈显著正相关;利用图像识别技术鉴定了200份重组自交系群体在PEG6000模拟干旱胁迫后的绿叶率,结合基因型数据开展了QTL定位分析,定位了多个耐旱QTL(未发表)。

2.2.3 产量

干旱,尤其是生殖生长阶段的干旱影响穗发育、开花受精和灌浆成熟,造成产量减少,如穗长变短、一次枝梗和二次枝梗减少、穗粒数减少[23]。干旱可导致花粉育性降低进而降低结实率[25],而灌浆不饱满会使千粒重下降,此外还会引起整精米率下降、垩白增加等,使稻米品质下降[26]。因此,干旱条件下的产量是评价耐旱性最重要的指标,也是育种实践最终的评判和选择标准。耐旱系数是指干旱处理产量与对照处理产量的比值,只反映品种对干旱的敏感程度,不代表品种在干旱胁迫下产量绝对值的高低[2]。耐旱指数是测试品种耐旱系数与对照品种耐旱系数的比值,对照品种一般选高产稳产且耐旱性较好的品种。

3 水稻耐旱性研究进展

3.1 稻种资源的耐旱性评价

耐旱资源的发掘与创新利用是水稻耐旱性研究的重要内容。自二十世纪七十年代以来,国内外科研人员开展了大量的水稻抗旱性鉴定评价。“七五”期间我国把水稻品种资源抗逆性鉴定列为国家重点科技项目。但长期以来水稻抗旱性的鉴定评价并没有区分避旱性和耐旱性。

由于缺乏专用设施,耐旱性的资源鉴定评价主要局限在芽期和苗期。陆岗等[4]对广西的464份栽培稻种质资源进行了苗期耐旱性鉴定,筛选出31份耐旱性强的种质资源。蒋荷等[28]利用育苗盘对1 777份国内外资源进行了苗期耐旱性鉴定,依据卷叶程度对参试资源进行了耐旱性分级,并对20份不同耐旱级别的资源进行了盆栽耐旱性鉴定。胡继芳等[29]、Khan等[30]采用盆栽法对水稻种质资源进行耐旱性评价。王宝祥等[31]在深度为50 cm的水泥池中对91份国内外水稻品种进行了耐旱性鉴定,根据生物量和产量等相关性状胁迫系数进行耐旱性评价,筛选出强耐旱品种17份,耐旱品种69份。本实验室分别利用PEG胁迫处理和“薄膜隔断浅土层鉴定法”进行了苗期和幼穗分化至抽穗期的耐旱性鉴定,对水稻微核心种质和抗旱核心种质开展了耐旱性鉴定,获得了部分耐旱种质资源,如‘IAC1246’‘IR30358-084-1-1’‘TRESMESES’‘绿旱1号’‘QINGSIZHAN 1’等[23]。

3.2 水稻耐旱性的遗传基础研究

早期水稻耐旱性研究多集中在苗期耐旱QTL的定位,研究指标主要有细胞膜稳定性、相对生长速率、相对生物量、叶片持绿性等。Yue等[32]利用旱稻品种‘IRAT109’和水稻品系珍汕97B构建重组自交系群体,分别在黏土和砂土两种条件下进行抗旱性QTL定位研究,未发现共定位QTL。在砂土干旱试验中定位到5个抗旱系数相关的QTL,其中3个与根系QTL共定位。黏土干旱试验在第2染色体的RM279—RM555区间定位到1个抗旱系数相关QTL和1个冠层温度相关QTL,比对分析发现与该区间共定位的有1个渗透调节相关的QTL[33]。以上结果表明,避旱性和耐旱性具有不同的遗传基础。Tripathy等[34]利用104个DH系在抗旱大棚里开展耐旱性评价,不同株系的细胞膜稳定性存在显著差异,变异呈现连续分布,推测其由微效多基因控制;利用315个分子标记开展连锁分析,定位了9个与细胞膜稳定性相关QTL,分别位于第1、3、7、8、9、11和12号染色体,解释的表型变异率在13.4%—42.1%。Kato等[3]利用‘Akihikari’与‘IRAT109’构建1个含有106个株系的BC1F6群体,采用聚乙二醇(PEG6000)模拟干旱胁迫,根据相对生长速率定位了3个耐旱性QTL,分别位于第2、4和7号染色体。本实验室利用PEG6000模拟干旱胁迫,开展珍汕97B∕‘IRAT109’重组自交系群体(159个株系)的耐旱性评价,通过对水稻苗期株高、根长、苗高增长速率、苗高∕根长比值、卷叶级别等性状进行分析,共检测到24个相关的QTL,贡献率在7.35%—39.30%;正常条件下检测到13个相关的QTL位点,分布在第1、2、3、5、6、10、12号染色体上;干旱胁迫条件下检测到11个相关的QTL位点,分布在第1、3、5、7、10、12号染色体上;其中,在1号染色体RM302—RM476B区间检测到控制叶卷曲位点,正向效应来源于珍汕97B等位基因[35]。You等[36]使用相同的RIL群体在苗期进行ABA胁迫处理,在1号染色体RM237—RM302区间定位到叶卷曲相关位点(qLRC-1),其增效等位基因来源于珍汕97B。

华中农业大学熊立仲教授团队利用高通量表型鉴定平台可见光成像技术进行了水稻耐旱性全基因组关联分析。利用盆栽试验方法对507份水稻种质开展了耐旱性评价,鉴定了生物量相关性状、叶片持绿性相关性状、植株形态性状等,通过全基因组关联分析定位了470个显著关联位点,其中有437个位点与前人报道的抗旱QTL区间位置一致,313个关联位点可以在两年的试验中重复定位到,过量表达OsPP15基因使植株对干旱更加敏感[37]。

3.3 水稻耐旱性功能基因研究

水稻作为最早完成全基因组测序的模式作物,其分子生物学和功能基因组学研究已取得较大发展。利用突变体筛选、基因表达芯片、比较转录组等方法发掘了大量的耐旱相关候选基因,相当一部分基因的耐旱性功能也通过转基因得到证实(表1)。这些基因主要可分为三大类:(1)信号转导基因,包括Ca2+结合蛋白(CaM、CDPK等)、细胞周期蛋白激酶(MAPK、MAPKKK)等编码基因[38-39];(2)转录因子基因,如AP2∕EREBP、bZIP、MYB∕MYC、WRKY、Zinc finger、NAC、GT编码基因[40-41];(3)具有保护或其他调节转运功能的蛋白基因,如E3泛素连接酶、海藻糖合成酶等编码基因[42-43](表1)。

表1 部分已被克隆耐旱基因Table 1 Partial cloned drought tolerant genes

干旱胁迫下的信号转导是干旱响应分子调控机制的重要环节。水稻中的DSM1基因属于MAPKKK家族,其突变体在幼苗期和幼穗分化期对干旱的敏感性强于野生型,过量表达DSM1基因使水稻幼苗的抗失水能力显著增强[38]。水稻钙依赖型蛋白激酶OsCPK9受ABA、PEG6000和盐胁迫等诱导表达,该基因可以改善干旱胁迫条件下的渗透调节能力并关闭气孔,正向调控水稻耐旱性和结实率[42]。另外,过量表达钙依赖型蛋白激酶OsCDPK7可以提高水稻对干旱等逆境条件的耐受性[72]。

过表达AP2∕ERF转录因子SUB1A可提高水稻耐旱性和耐淹能力[40]。过表达乙烯响应元件结合蛋白基因OsEREBP1会激活脱落酸和茉莉酸合成通路相关基因以及防卫反应信号,提高转基因水稻的耐淹性和耐旱性,同时增强抗白叶枯病的能力[47]。过量表达OsERF71可促进ABI5和PP2C68基因上调表达,提高水稻在干旱条件下的产量[73]。多个NAC家族转录因子如SNAC1、SNAC3、OsNAC5、OsNAC6、OsNAC14和ONAC22等正向调控水稻耐旱性。bZIP家族转录因子OsbZIP23、OsbZIP33、OsbZIP40、OsbZIP42、OsbZIP45、OsbZIP62、OsbZIP66、OsbZIP71等也已被证实可正调控水稻的耐旱性。OsMYB48-1受干旱、脱水、H2O2、盐、低温等非生物逆境诱导表达,过量表达OsMYB48-1可以提高植株耐旱性(存活率),表现为脯氨酸含量升高,丙二醛含量下降。锌指类转录因子DST与活性氧相关基因启动子中的DBS元件直接结合,通过影响活性氧的积累和气孔开闭,实现对植株耐旱性和耐盐性的调控。而且DST基因还通过调控Gn1a∕OsCKX2的表达提高水稻产量[74]。过量表达WRKY家族中OsWRKY11可以提高转基因水稻苗期耐旱性和对白叶枯病的抗性[64]。

本实验室结合抗旱QTL定位和表达谱数据,从抗旱QTL区间内克隆了正向调控水稻耐旱性基因OsGRAS23和OsAHL1,其过量表达可以提高苗期干旱胁迫存活率和生殖生长期干旱胁迫下的产量[70-71]。OsbZIP62是耐旱水稻品种干旱胁迫下转录调控网络的节点基因,过量表达该基因可以提高水稻苗期干旱胁迫下的存活率[56]。

3.4 水稻耐旱性的多组学研究

在过去的20年里,转录组、蛋白质组和代谢组等组学技术被广泛应用于水稻耐旱研究中,极大地推进了对逆境下植物响应基因和调控网络的识别[75-76]。通过比较耐旱品种和敏感品种干旱处理前后组学成分的含量变化,发掘重要的基因、蛋白质或代谢物。在转录组研究中,耐旱与敏感品种的差异基因集中在信号转导、转录调控、细胞壁修饰相关途径,以及渗透调节、活性氧清除及能量代谢相关的途径[7]。本实验室利用3个耐旱品种(‘IAC1246’‘矮密’‘TRESMESES’)和3个耐旱性较差的品种(‘CICA4’‘IRAT109’‘IPECA0162’)鉴定了344个响应干旱胁迫的microRNA,进一步分析发现其中21个microRNA同时与耐旱性和产量存在正向相关作用,推测其具有较大的育种价值[77]。另外,在耐旱品种‘IAC1246’和耐旱性较差的品种‘IRAT109’中进行应答干旱胁迫的转录组学和代谢组学分析,分别鉴定到2 677个和4 059个耐旱基因以及47个和69个差异代谢物,‘IAC1246’表现出更好的抗氧化能力和光合作用能力,其差异基因可以被显著富集到抗氧化相关代谢途径(如类黄酮代谢途径、抗坏血酸代谢途径、谷胱甘肽代谢途径等)和光合代谢相关途径。在应答干旱胁迫过程中很多与光合作用有关的基因在‘IAC1246’中上调表达,光合保护剂阿魏酸含量急剧上升[7]。

此外,近年来研究人员逐渐将组学技术与GWAS技术联合以用于耐旱基因的发掘,如利用转录组获得e-QTL[78]、利用代谢组获得meta-QTL[79]、利用光谱等表型组技术获取i-QTL[37]。本实验室目前在利用多光谱技术对重组自交系群体进行耐旱性鉴定。

4 结语与思考

水稻的抗旱育种要兼顾避旱性和耐旱性。提高避旱性可以提高水稻对水分的吸收能力并减少植株水分散失;而增强耐旱性可以提高水稻对缺水的耐受能力,维持其正常的生理代谢功能[80-82]。

耐旱性和避旱性各自具有明显的形态学与生理生化特性及不同的遗传基础和调控机制[32]。科学区分不同的抗旱机制并根据其特性开展鉴定评价是水稻抗旱研究的基本立足点。自然条件下,当干旱发生时,各抗旱机制因植株个体的发育时期、干旱的严重程度及发展进程等,可能先后或同时在植株的不同或相同的组织部位发挥作用,植株个体最终的抗旱表现是各种机制共同作用的结果。

在耐旱性遗传分析中,要考虑两个因素:一是耐旱鉴定应尽可能在大田环境中进行,尽量规避避旱性的干扰;二是需具备一定规模的群体和高密度的基因型数据,使耐旱性QTL的定位可以精准到单基因水平。虽然已在水稻中克隆了大量的耐旱基因,但耐旱性的标记辅助选择育种进展缓慢。可能有几个方面的原因:一是有相当一部分基因仅在苗期进行功能验证,未在生殖生长期进行耐旱性评价;二是基因效应较小,植株耐旱性提升不明显;三是基因可能对植株生长发育、产量或品质存在负效应[82]。综上,需要进一步发掘具有育种价值的耐旱基因。

总的来说,水稻的耐旱性在鉴定方法、资源评价、遗传基础和功能基因研究等方面都积累了大量成果,但从实现全基因组选择设计育种以及智能育种的目标来看,还有大量的工作有待开展。(1)水稻耐旱性是由微效多基因调控的,调控网络和调控机制仍然需要深入研究。(2)新的技术可以进一步应用于耐旱性研究中。例如,单细胞测序可用于了解组织中各细胞内及细胞间的基因表达与调控,判别各类细胞参与的生理生化反应。基因组、表型组等多组学高效检测技术可以促进耐旱性遗传基础的解析,加快基因发掘的效率。(3)各组学的联合应用,包括一些特殊的组学分析,如甲基化组、脂质蛋白组,磷酸化修饰蛋白组等,为耐旱性状的遗传模型构建及人工智能设计育种提供了更多的数据支撑。(4)CRISPR∕Cas9技术能够精确地编辑基因,可以根据需要快速创制新等位基因或者替换为有利等位基因。随着越来越多的耐旱基因被发掘,可能在不久的将来就能实现水稻耐旱性分子设计育种[83]。