基于HPLC-MS/MS法的脑灵素制剂中人参掺伪检查研究

穆向荣，徐兴燕，焦阳，许丽丽,2，尹雪，林永强*，林慧彬

(1.山东省食品药品检验研究院，国家药品监督管理局胶类产品质量评价重点实验室，中药标准创新与质量评价工程实验室，中药配方颗粒共性技术山东省工程研究中心，山东 济南 250101；2.山东中医药大学，山东 济南 250355；3.山东省中医药研究院，山东 济南 250014)

脑灵素系列制剂包括片剂和胶囊剂2种剂型，处方组成一致，均由人参、鹿茸、黄精、淫羊藿等十五味药组成，具有补气血，健脑安神的功效。处方中人参为五加科植物人参(PanaxginsengC.A.Mey.)的干燥根和根茎，具有大补元气，复脉固脱等功效[1]。近年来，多次报道西洋参冒充人参进行含人参制剂的投料生产[2-3]。西洋参为五加科植物西洋参(P.quinquefoliumL.)的干燥根，具有补气养阴，清热生津的功效[1]。两味药材性味、临床应用和功能主治互不相同，所含皂苷种类与含量及比例有一定的差异[4-9]，若用西洋参掺入人参或直接充作人参进行投料生产，可能会影响制剂的有效性。研究发现西洋参中拟人参皂苷F11含量较高，而人参中基本不含，因此，拟人参皂苷F11可作为非法投料使用的依据。

1 仪器、试剂与样品

仪器：AB SCIEX Triple Quad 6500+高效液相色谱-质谱联用仪；岛津8050三重四级杆串联质谱仪；Sartorius CP225D电子天平。

试剂：乙腈、为色谱纯，甲醇为分析纯，水为超纯水。

对照品：拟人参皂苷F11(中国食品药品检验研究院提供，批号：110841-201617；上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：3711；成都曼斯特生物科技有限公司，批号：MUST-21051408；上海甄准生物科技有限公司，批号：22B211-B2)。

参比样品及阴性对照样品：本课题组按照规定的处方量及工艺自制脑灵素胶囊、片各1批，作为参比样品使用；自制缺人参药味的脑灵素胶囊、片各1批，作为阴性样品使用。

人参、西洋参购于河北安国中药材市场，经宋希贵主任中药师鉴定均为正品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱内径2.1 mm)；以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱程序见表1；流速为0.35 mL·min-1；柱温为40 ℃，进样量为5 μL。

表1 梯度洗脱程序

2.2 质谱条件 电喷雾负离子模式(ESI-)，进行多反应监测(MRM)。质谱参数详见表2。

表2 监测离子对、去簇电压、碰撞能量

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液 精密称取拟人参皂苷F11(中国食品药品检验研究院提供，批号：110841-201617)10.79 mg，置100 mL量瓶中，加20%乙腈使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为拟人参皂苷F11对照品贮备溶液(C浓度=0.107 9 mg·mL-1)。精密量取适量，用20%乙腈稀释制成每1 mL含4 ng的溶液，即得。

精密称取不同来源的拟人参皂苷F11对照品(上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：3711；成都曼斯特生物科技有限公司，批号：MUST-21051408；上海甄准生物科技有限公司，批号：22B211-B2)适量，同法制备对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液 取脑灵素片适量，除去糖衣；或取脑灵素胶囊内容物适量，研细，取约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，称定重量，置80 ℃水浴中加热回流75 min，取出，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

2.4 测定 分别精密吸取上述对照品及供试品溶液各5 μL，注入液相色谱-质谱联用仪，测定。

3 方法学验证

3.1 专属性实验 拟人参皂苷F11对照品溶液制备：照“2.3.1”项下的对照品溶液制备方法制备。

阴性对照溶液的制备：取人参阴性样品1 g，按“2.3.2”项下供试品溶液的制备方法制得阴性对照溶液。

参比溶液的制备：取参比样品1 g，按供试品溶液的制备方法制得参比溶液。

阳性对照溶液的制备：取人参阴性样品1 g和西洋参6.7 mg(相当于1 g制剂中人参药材的处方量)，制备阳性制剂，再按供试品溶液的制备方法制得阳性样品溶液。

西洋参供试品溶液的制备：取西洋参6.7 mg，按供试品溶液的制备方法制得西洋参样品溶液。

分别精密吸取上述溶液各5 μL，注入液相色谱-质谱联用仪，测定。结果发现参比样品和阴性样品均未检出拟人参皂苷F11成分，阳性样品和西洋参药材中均检出拟人参皂苷F11成分，说明脑灵素制剂中其他药味对测定无干扰。选择离子色谱图见图1。

图1 专属性试验 (自上往下依次为：拟人参皂苷F11对照品、阴性样品、参比样品、阳性样品、西洋参药材；左侧为m/z 799.6→653.6离子，右侧为m/z 799.6→491.6离子)

3.2 基质效应考察 脑灵素制剂处方复杂，药味较多，且处方中人参投料量较低，故需对制剂基质效应考察。试验中，以自制参比样品按“2.3”项下供试品溶液的制备方法得到基质溶液2 mL，精密加入2.158 μg·mL-1人参皂苷F11对照品溶液10 μL，混匀，即得含107.9 ng·mL-1拟人参皂苷F11的基质溶液。再用20%乙腈溶液制的相同浓度的拟人参皂苷F11溶液，同时进样比较。结果表明，脑灵素样品基质溶液使待测成分的响应值明显降低，基质效应明显。在限度制定和相关方法学考察时应考虑基质效应，结果见表3、图2。

表3 基质效应考察数据

图2 基质考察试验 (上图为20%乙腈溶液，下图为脑灵素样品基质；左侧为m/z 799.6→653.6离子，右侧为m/z 799.6→491.6离子)

3.3 精密度试验 精密吸取浓度为43.16 ng·mL-1的拟人参皂苷F11对照品溶液5 μL，注入液相色谱-质谱联用仪，连续进样6次，进行测定。结果表明，仪器精密度良好。

3.4 重复性试验 选取阳性样品(批号：200403)，按“2.3.2”项下供试品溶液的制备方法平行制备6份供试品溶液，精密吸取5 μL，注入液相色谱-质谱联用仪，测定，以m/z 799.6→653.6离子峰面积值，计算重复性。结果显示，方法重复性良好。

3.5 回收率试验 考虑到基质效应对待测成分峰面积影响大，本实验室以自制参比样品按“2.3.2”项下供试品溶液的制备方法得到基质溶液，以此来制备系列对照品溶液(10.79、21.58、43.16、107.9、215.8、431.6 ng·mL-1)。精密吸取上述系列基质对照品溶液各5 μL，注入液相色谱-质谱联用仪，测定。以m/z 799.6→653.6离子峰面积值为纵坐标，以拟人参皂苷F11浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果可见，拟人参皂苷F11浓度在10.79～431.6 ng·mL-1范围内与峰面积积分值线性关系良好，回归方程Y=461.68X-1 797.7,r=0.999 2。

将重复性项下样品测定峰面积带入上述回归方程计算含量为11.83 μg·g-1。取同批次阳性样品0.5 g，平行制备6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加80%甲醇25 mL，再分别精密加入1.079 μg·mL-1的拟人参皂苷F11对照品溶液0.5 mL，称定重量，置80 ℃水浴中加热回流75 min，取出，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密吸取5 μL，注入液相色谱-质谱联用仪，测定m/z 799.6→653.6离子峰面积值，计算回收率。

结果显示，回收率平均值为99.3%，RSD为45%方法精密度良好。

3.6 稳定性考察 取4.316 ng·mL-1的拟人参皂苷F11对照品溶液，分别于制备后0、8、12、16、20、24 h进样，以m/z 799.6→653.6作为检测离子对进行测定。取阳性样品，按“2.3.2”项下供试品溶液制备方法制备，常温保存，分别于制备后0、8、12、16、20、24 h进样，以m/z 799.6→653.6，作为检测离子对进行测定。

结果表明，对照品溶液和供试品溶液在24 h内稳定性良好，可以满足检测需要。

3.7 检测限 以响应值相对较低的m/z 799.6→491.6作为检测离子进行检测，浓度为0.025 18 ng·mL-1的拟人参皂苷F11对照品溶液上述离子的信噪比约为3。

3.8 色谱柱耐用性试验 对不同色谱柱型号进行了考察，结果显示，3种型号的色谱柱均能实现拟人参皂苷F11的测定，该方法对色谱柱耐用性良好，结果见表4和图3。

表4 不同型号色谱柱考察

图3 色谱柱考察选择离子流色谱图 (自上往下依次为：色谱柱编号1、2、3；左侧为m/z 799.6→653.6离子，右侧为m/z 799.6→491.6离子)

3.9 仪器耐用性试验 为了适应不同灵敏度的仪器，考察本方法在岛津8050三重四级杆串联质谱仪和AB 6500+高效液相色谱-质谱联用仪上的重现性，离子流色谱见图7～8。结果表明拟人参皂苷F11成分在上述仪器上可检出，本方法对仪器耐用性良好。

3.10 掺伪比例考察 据研究报道，人参药材中可检测出少量拟人参皂苷F11，其含量远低于西洋参。同时也存在由于客观原因，人参中混入少量西洋参的情况，因此对人参中掺入不同比例西洋参后的制剂检测情况进行考察。

将人参药材中加入适量西洋参，分别制成含3%、5%、10%西洋参的人参混合样品，分别称取上述人参混合样品6 mg，再加入脑灵素阴性对照样品1 g，混匀，按“2.3.2”项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液。分别精密吸取上述溶液各5 μL，注入液相色谱-质谱联用仪，测定。

结果显示，当人参中西洋参掺入量为3%、5%时，响应值相对较低的m/z 799.6→491.6检测离子信噪比均小于3，视为未检出；当掺入量为10%时，m/z 799.6→491.6检测离子信噪比大于3，视为检出。

4 结果测定

按照上述拟定检验方法，对66批脑灵素制剂样品进行检查，结果36批样品检出拟人参皂苷F11成分，检出率为54.5%，结果见表5。

表5 脑灵素制剂拟人参皂苷F11检查结果

表5(续)

5 讨论

5.1 不同来源对照品对检出结果的影响 为保证检测结果的准确性，分别用不同来源的拟人参皂苷F11对照品配制对照品溶液，对66批脑灵素制剂样品进行检查，拟人参皂苷F11检出结果一致，说明不同来源的对照品对样品检出结果无影响。

5.2 结果分析 现行版药典规定的人参与西洋参来源不同，两味药材性味、临床应用和功能主治互不相同，所含皂苷种类与含量及比例有一定的差异。前期调研发现，不法商家用西洋参边角料冒充人参，用于含人参的中药制剂。若用西洋参掺入人参或直接充作人参进行投料生产，可能会影响制剂的有效性。本试验建立的液质联用的检查方法能够准确判定脑灵素制剂中是否存在西洋参边角料冒充人参使用的问题，可为脑灵素类制剂质量标准的完善提供参考。