烟草—荞麦轮作对烟草黑胫病防治及土壤微生态的调控作用

孟祥佳，刘 洋，黎妍妍，许汝冰，李传仁，周 燚，孙正祥*，李锡宏*

（1长江大学农学院，湖北荆州 434025；2 湖北省烟草科学研究院，湖北武汉 430030）

0 引言

【研究意义】由烟草寄生疫霉（var.）侵染引起的烟草黑胫病（Tobacco black shank）是烟草上的一种毁灭性土传病害，几乎危害所有类型的烟草，对烟草行业造成巨大的经济损失（Guo et al.，2020；Ma et al.，2020）。烟草疫霉在没有寄主植物的土壤中也能存活数年，即使高抗品种也会受到病原菌侵染（孙计平等，2011）。化学药剂防治会使病原菌产生抗药性，在杀死病原菌的同时也会破坏土壤微生态结构（庄红娟等，2021）。多年烟草连作会降低土壤的理化性质，使土壤中有益微生物种群数量下降而病原菌数量呈上升趋势（杨宇虹等，2012）。轮作可提高土壤肥力和团聚体稳定性，调控土壤微生物群落结构，抑制根际病原菌的生长，减缓病原菌对寄主植物的侵染（李锐等，2015；韩芳等，2021）。因此，开展烟草轮作调控的研究，对缓解烟田连作障碍和田间黑胫病的防治具有重要意义。【前人研究进展】目前已有轮作防治烟草土传病害和改善土壤微生物群落的相关报道。钏有聪等（2016）通过平板试验证明大蒜根系分泌的苯并噻唑、二烯丙基二硫醚和烯丙基甲基二硫醚等抑菌物质可有效抑制烟草黑胫病菌菌丝生长，大蒜与烤烟轮作可降低烟草黑胫病的发病率，增加烟叶产量；Fang等（2016）使用毛细管根模型证明油菜根系具有很强的吸引游动孢子的能力，并通过气相色谱—质谱联用仪（GC-MS）和平板试验证明油菜根分泌的2-丁烯酸、戊酸、4-甲氧基吲哚、环己基异氰酸酯、苯并噻唑、2-（甲基噻唑）苯并噻唑和1-（4-乙基苯基）-乙烷对烟草黑胫病菌菌丝生长具有显著的抗菌活性，油菜与烟草轮作可显著降低烟草黑胫病的发病率，使烟叶产量提高128.8%；Niu等（2017）进行烟草分别与玉米、百合和萝卜轮作田间试验，结果显示，烟草—玉米轮作对烟草青枯病的防效最明显，与连作田相比发病率下降59.26%，并且烟草—玉米轮作土壤细菌群落多样性显著高于其他处理，确定细菌群落多样性与烟草青枯病率呈负相关；黎妍妍等（2021）通过Illumina Hiseq扩增子测序技术证明，烟草移栽后100 d，万寿菊与烟草轮作田中Sobs、Shannon和Chao1等多样性和丰富度指数较连作田上升5.41%、4.00%和13.02%，轮作田提升土壤中酸杆菌门（Acidobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度，显著增加了多种生防菌、降解菌和根际促生菌的菌属丰度，有利于缓解连作障碍；伍晓丽等（2022）发现烟草与玄参轮作对土壤真菌和细菌的多样性均无显著影响，但对土壤酶活性和pH有不良影响。结合前人研究发现，不同的作物与烟草轮作主要通过改善土壤微生态环境和分泌抑菌化合物两种机制减少烟草土传病害的发生和危害，但并非所有轮作方式都能获得理想效果，并且与当地气候及土壤环境有密切关系。烟草长期连作不仅影响作物的产量和品质，也会对土壤生态环境造成危害，如何有效解决连作障碍成为国内外学者的研究热点之一。荞麦（Moench）是一种生育期短、抗逆性强，适合种植于贫瘠、寒冷和高海拔环境的蓼科植物，具有很高的营养价值和药用价值（高扬等，2014；张晓娜等，2019；方齐国等，2022）。已有研究表明荞麦与马铃薯轮作提高了土壤速效磷、全氮、有机质含量及酶活性，改变了微生物群落结构（刘亚军等，2018）；荞麦与油菜、玉米、马铃薯、燕麦4种作物轮作均提高了土壤大团聚体数量、稳定性及土壤的固碳能力（范倩玉等，2021）；荞麦与咖啡间作试验中荞麦通过吸引咖啡潜叶蛾对其自身的取食和寄生从而减少对咖啡的为害（da Consolação Rosado et al.，2021）。【本研究切入点】目前，国内外关于烟草—荞麦轮作（简称烟荞轮作）防治烟草黑胫病，调控土壤微生物群落结构的研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】选择湖北省恩施市宣恩县烟草黑胫病发病严重的烟田进行烟荞轮作，调查田间烟草黑胫病发病情况，运用实时荧光定量PCR检测烟荞轮作下烟草根际黑胫病菌数量的变化，运用Illumina高通量测序分析烟荞轮作对烟草根际微生物丰富度、多样性及群落结构的影响，明确烟荞轮作对烟草黑胫病的防治作用，为缓解烟草连作障碍及烟草黑胫病害提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验区及试验材料

1.1.1 试验材料 供试烟草：云烟87，由湖北省烟草科学研究院提供；供试荞麦：甜荞，由长江大学农学院提供。

1.1.2 供试病原菌菌株 烟草黑胫病菌（var.）、水稻纹枯病菌（）、玉米茎基腐病菌（）、西瓜枯萎病菌（f.sp.）和小麦赤霉病菌（），均由长江大学农学院植物与微生物互作研究室提供。

1.1.3 主要试剂 土壤微生物DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶检测回收试剂盒和细菌质粒DNA提取试剂盒（Omega Engineering）；pMD18-T载体（宝生物工程有限公司）；大肠杆菌DH5α（上海唯地生物技术有限公司）；qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒（翌圣生物科技股份有限公司）。

1.1.4 主要仪器 T100 PCR仪、BIO-CFX96荧光定量PCR仪、Universal Hood II凝胶成像仪（伯乐生命医学产品有限公司）；NanoDrop 2000超微量分光光度计（广州硕谱生物科技有限公司）；Mupid-2plus电泳仪（宝生物工程有限公司）。

1.1.5 试验地点及烟草和荞麦种植 试验地点位于海拔800 m的湖北省恩施市宣恩县椒园镇（北纬30°01′，东经109°4′），常年种植烟草，黑胫病逐年加重，发病率接近100%。试验设2个处理，处理1：连作，烟草—烟草—烟草，连续种植烟草（C）；处理2：烟荞轮作，烟草—荞麦—荞麦—烟草（R），即第1年4月在烟草移栽前20 d整地，按烟草生产技术要求在烟田施底肥、起垄、定距移栽烟苗，在烟草行间种植荞麦，9月底烟叶和荞麦收获后，清除田间烟杆、荞麦桩及杂草，并及时对烟田进行深翻，然后按荞麦生产技术要求整地、施肥和种植荞麦；第2年4月继续整地、起垄，种植烟草和荞麦，要求轮换种植烟草和荞麦的位置，如此反复进行烟草—荞麦—荞麦—烟草轮作种植。每处理3次重复，共6个小区，每小区种植50株烟草。

1.2 试验方法

1.2.1 烟荞轮作下烟草黑胫病发病情况调查 分别在烟草移栽后45、60、75和90 d，每小区定点10株烟草，调查烟草—烟草—烟草（C）和烟草—荞麦—荞麦—烟草（R）模式下的烟草黑胫病发生情况。黑胫病病情分级参照GB/T 23222—2008《烟草病虫害分级及调查方法》，调查轮作田与连作田烟株的黑胫病发生情况，并根据公式计算病情指数。

1.2.2 烟荞轮作对烟草根际黑胫病菌数量的影响参照Cui等（2015）的方法收集烟草根际土壤。分别在烟草移栽后45、60、75和90 d，每小区定点取样10株烟草根际土壤，烟草—烟草—烟草（C）和烟草—荞麦—荞麦—烟草（R）2组处理依据取样时间分别记作C（C_45、C_60、C_75、C_90）、R（R_45、R_60、R_75、R_90），立即装入冷却箱送实验室。按照土壤微生物DNA试剂盒说明书提取烟草根际土壤总DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，通过超微量分光光度计检测土壤总DNA浓度和纯度，-20 ℃保存备用。

根据NCBI数据库中烟草黑胫病的基因，并利用NCBI中的Primer-BLAST设计特异性引物Tb166F（5'-CCACGGCAAAACCTACA-3'）/Tb166R（5'-CGGAAGTTCATTTCGGAT-3'）（由武汉华大基因有限公司合成）用于烟草黑胫病菌DNA的常规和实时荧光定量PCR检测，其扩增长度为166 bp。采用CTAB法提取供试病原菌DNA，分别用水稻纹枯病菌、玉米茎基腐病菌、西瓜枯萎病菌和小麦赤霉病菌DNA检测该引物的特异性。以烟草黑胫病菌DNA为模板，用特异性引物进行常规PCR扩增。反应体系25.00 μL：2×Master Mix 12.5 μL，DNA模板1.0 μL，正、反向引物各1.0 μL，加ddHO 至25.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃60 s，进行35个循环；72 ℃延伸8 min，16 ℃保存。反应结束后，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测及回收，将回收产物克隆至pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后提取质粒DNA并送至武汉华大基因有限公司进行核酸测序。

参照申永铭等（2017）的方法计算得出质粒DNA初始浓度为3.46×10copies/μL，-20 ℃保存待用。采用10倍稀释法对初始质粒进行稀释，制成3.46×10～3.46×10copies/μL 9个浓度梯度的质粒标准品，每个梯度进行常规PCR和实时荧光定量PCR扩增，5次重复。实时荧光定量PCR使用qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒进行扩增。反应体系20.0 μL：上、下游引物各1.0 μL，qPCR SYBR Green Master Mix 10.0 μL，DNA模板1.0 μL，加ddHO至20.0 μL。扩增程序：96 ℃预变性1 min；95 ℃15 s，55 ℃35 s，72 ℃30 s，进行35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。通过凝胶电泳成像及扩增曲线检测引物Tb166F/Tb166R的灵敏度，通过扩增曲线对应的t值绘制标准曲线。以上述定点取样的土壤总DNA为模板，用特异性引物Tb166F/Tb166R进行实时荧光定量PCR扩增，每个样品5次重复，根据t值计算土壤中黑胫病菌的含量。

1.2.3 烟荞轮作对烟草根际微生态的影响 烟草移栽后75 d采集根际土壤，送至上海美吉生物公司进行高通量测序分析。具体方法：取0.5 g土壤样品，用DNeasy ProwerSoil Pro Kit试剂盒提取土壤总DNA，以此为模板，用细菌引物338F（5'-ACTCCTAC GGGAGGCAGCAG-3'）/806R（5'-GGACTACHVGG GTWTCTAAT-3'）和真菌引物ITS1F（5'-CTTGGTC ATTTAGAGGAAGTAA-3'）/ITS2R（5'-GCTGCGTT CTTCATCGATGC-3'）进行PCR扩增。在美吉生物云平台（https：//cloud.majorbio.com）进行数据分析，使 用Mothur 计 算Alpha 多 样 性 中 的Sobs、Chao1、Shannon和Coverage等指数，使用Uparse进行聚类分析，并根据聚类分析结果对分类单元进行排序生成微生物群落分布组成Heatmap热图，使用Student’s检验进行Alpha多样性的组间差异分析；使用基于Bray-Curtis距离算法的主坐标分析（PCoA分析）检验样本间微生物群落结构的相似性。

1.3 统计分析

使用Excel 2019和SPSS 13.0进行试验数据统计分析，对各组数据均采用Duncan’s新复极差法进行多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 烟荞轮作对烟草黑胫病的防治作用

由表1可看出，烟草移栽后45、60、75和90 d，轮作田的烟草黑胫病病情指数均显著低于连作田（＜0.05，下同），分别较连作田低35.59%、36.22%、46.53%和11.52%。

2.2 烟荞轮作对烟草根际黑胫病菌数量的影响

2.2.1 引物特异性验证结果 常规PCR检测烟草黑胫病菌DNA能扩增出约160 bp大小的特异性条带，而其他供试菌株和ddHO均未扩增出条带（图1-A）；实时荧光定量PCR检测5种供试病原菌DNA中只有烟草黑胫病菌DNA有值，其他病原菌和ddHO均无值（图1-B），表明扩增所用引物具有较强的特异性，可用于后续烟草黑胫病菌的检测。

2.2.2 标准曲线建立 质粒DNA经10倍系列稀释后，制成3.46×10～3.46×10copies/μL共9个浓度梯度的质粒标准品，进行常规PCR和实时荧光定量PCR扩增。由图2-A可知，在常规PCR中，条带亮度随模板拷贝数浓度降低而逐渐变暗，当拷贝数浓度为3.46×10copies/μL时条带模糊不清，因此常规PCR的模板稀释下限为3.46×10copies/μL。由图2-B可知，实时荧光定量PCR中值随模板浓度降低而增加，可检测到质粒DNA浓度下限为3.46×10copies/μL，因此实时荧光定量PCR的模板稀释下限为3.46×10copies/μL。实时荧光定量PCR灵敏度是常规PCR的1000倍，且熔解曲线均为单峰（图2-C），证明各浓度不存在特异性扩增。根据扩增曲线建立烟草黑胫病菌和值间的标准曲线，黑胫病菌（）与对应的值（）间具有良好的线性关系，回归方程为=-3.1571+41.953，相关系数为0.9992。

2.2.3 烟草根际黑胫病菌的实时荧光定量PCR检测 提取烟草—烟草—烟草（C）和烟草—荞麦—荞麦—烟草（R）的土壤总DNA，根据实时荧光定量PCR标准曲线进行定量分析，结果（表2）显示，烟草移栽45、60和75 d的轮作田黑胫病菌孢子数量均显著低于连作田，分别较连作田低43.55%、86.81%和95.73%；移栽后90 d时，连作田的黑胫病菌孢子数量显著低于轮作田，较轮作田低43.86%。

2.3 烟荞轮作对烟草根际细菌和真菌多样性的影响

2.3.1 烟草根际微生物的Alpha多样性、韦恩和PCoA分析 微生物Alpha多样性指数中，Sobs指数、Shannon指数和Chao1指数分别表示微生物OTU丰度、多样性和丰富度。由表3可知，烟草移栽后75 d，轮作田和连作田烟草根际土壤真菌及细菌群落的覆盖率均高于98.00%，表明各处理土壤样品中的绝大多数序列均被检出，测序读长有利于后续相关分析的准确性。R_75 土壤细菌和真菌群落Shannon指数、Chao1指数均显著高于C_75处理，细菌群落Sobs、Shannon和Chao 1指数分别较C_75高23.70%、6.38%和24.32%；真菌群落Sobs、Shannon和Chao 1指数分别较C_75高24.51%、16.57%和41.17%。由韦恩分析（图3-A和图3-B）可知，R_75与C_75共有细菌及真菌OTU分别为2577和693；R_75特有细菌OTU为1176，是C_75特有细菌OTU的2.57倍；特有真菌OTU为587，是C_75特有真菌OTU的1.75倍。PCoA分析结果（图4-A和图4-B）显示，R_75的细菌和真菌样本分组椭圆聚集在一、四象限，C_75的细菌和真菌样本分组椭圆聚集在二、三象限，R_75样本分在PC1正值区域，而C_75样本分在PC1负值区域，表明轮作田与连作田烟草根际真菌和细菌群落结构及分布存在明显差异。

2.3.2 烟草根际微生物群落门水平上的组成与结构分析 选取R_75和C_75烟草根际细菌菌群丰度排名前15、真菌菌群丰度排名前10的菌门组成Heatmap图（图5），从图中可看出，R_75和C_75相对丰度超过1%的细菌菌门均为变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteriota）、髌骨细菌门（Patescibacteria）、粘球菌门（Myxococcota）、拟杆菌门（Bacteroidota）和厚壁菌门（Firmicutes），与C_75相比，R_75提高了放线菌门、芽单胞菌门、绿弯菌门、酸杆菌门和粘球菌门的丰度，分别较C_75高6.58%、23.58%、17.79%、38.22%和62.69%；减少了变形菌门、髌骨细菌门、拟杆菌门和厚壁菌门的丰度，分别较C_75低24.83%、62.87%、17.83%和17.85%。

R_75相对丰度超过1%的真菌菌门有被孢霉菌门（Mortierellomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、子囊菌门（Ascomycota）、未分类的真菌（unclassified_k-Fungi）和壶菌门（Chytridiomycota），C_75相对丰度超过1%的真菌菌门有被孢霉菌门、担子菌门、子囊菌门和未分类的真菌，与C_75相比，R_75提高了子囊菌门、壶菌门和未分类的真菌丰度，分别较C_75高20.47%、420.22%和21.12%；减少了被孢霉菌门和担子菌门的丰度，分别较C_75低56.52%和14.91%。

2.3.3 属水平上烟草根际微生物群落的相对丰度差异显著性分析 对相对丰度超过1%的土壤细菌属和真菌属进行差异显著性分析。从表4可看出，与C_75相比，细菌属中R_75显著增加了norank_o__、鞘氨醇单孢菌属（）、芽单胞菌属（）、慢生根瘤菌属（）、地杆菌属（）、芽生球菌属（）、念珠菌固体杆菌属（）、沙壤土杆菌属（）和芽孢杆菌属（）的丰度，显著降低了罗河杆菌属（）、微杆菌属（）、伯克霍尔德氏菌属（）、劳尔氏菌属（）和红球菌属（）的丰度；真菌属中R_75显著增加了亚隔孢壳属（）、规整霉属（）、短梗蠕孢属（）和芽枝霉属（）的丰度，显著减少了被孢霉属（）、新赤壳属（）、、赤壳属（）、木霉菌属（）和青霉菌属（）的丰度。

3 讨论

轮作可有效改善土壤理化性质和抑制植物病原菌生长（Tian et al.，2009；冯翠等，2022）。本研究的烟田病情调查与实时荧光定量PCR检测结果表明，烟草移栽后45、60和75 d，轮作田黑胫病病情指数和根际病原菌数量均显著低于连作田，75 d时差异最明显，表明烟荞轮作可有效延缓黑胫病菌生长和病害发生，与牟文君等（2016）报道花生与烤烟间作可减缓烟草黑胫病发生的结论一致。移栽后90 d烟草黑胫病病情指数持续上升而轮作田根际病原菌数量下降，可能是90 d时烟草处于成熟后期并且病情严重导致烟草根系活力下降，根际微生物整体丰富度降低，黑胫病菌数量随之减少（黄伟雄等，2021），而连作田烟草病情更加严重，根系活力更低导致病原菌数量低于轮作烟田。此外，田间小气候的改变也是影响土壤病原菌数量的重要原因（王传杰等，2017）。

土壤被认为是一个高度复杂和动态的生态系统，土壤微生物群落多样性与植物健康程度呈正相关（Luan et al.，2015；Poudel et al.，2016）。本研究Alpha多样性、韦恩和PCoA分析结果表明，轮作烟田与连作烟田根际真菌和细菌的群落组成及分布差异明显，轮作烟田的Shannon指数和Chao1指数均显著高于连作烟田，表明烟荞轮作提升了烟草根际微生物的多样性及丰富度。细菌门水平组成分析表明，轮作增加了有益细菌门放线菌门、绿弯菌门、酸杆菌门和有益真菌门子囊菌门、壶菌门的相对丰度。放线菌门可产生次生代谢产物有效抑制土传病原菌（杜用玺等，2020）；绿弯菌门和酸杆菌门主要分解土壤有机物中的多糖，在物质循环、维持土壤生态环境和植物营养状况等方面发挥着重要作用（Lladó et al.，2016；鲜文东等，2020）；壶菌门可分解纤维素和几丁质，促进土壤碳、氮循环（Sudová et al.，2020）；子囊菌门中的腐生菌可分解有机物促进土壤中碳的循环，有利于植物养分吸收（Purahong et al.，2016）。在细菌属水平上，鞘氨醇单孢菌属可降解土壤中的污染物多环芳烃（PAHs）（Song et al.，2021）；芽孢杆菌是一种常见的植物根际促生细菌，可通过多种抗病机制防治植物土传病害，其衍生产品约占商用生物农药的一半（Fira et al.，2018；李文鹏等，2020）；劳尔氏菌属可导致烟草青枯病的发生（樊俊等，2021）；慢生根瘤菌属可将空气中游离的氮气转化为植物可吸收的化合态氮（吴月等，2022）；沙壤土杆菌属可提高土壤酶活性，改善根际土壤的理化性质（Tang et al.，2020）；念珠菌固体杆菌属和芽单胞菌属是土壤中的纤维素降解菌，可将土壤中植物残体转化为有机质，并通过有机质库与微团聚体结合形成大团聚体以产生土壤团聚体（Wang et al.，2017）。轮作烟田中沙壤土杆菌属、念珠菌固体杆菌属和慢生根瘤菌属的显著增加与黎妍妍等（2021）的万寿菊—烟草轮作研究结果一致。轮作烟田显著增加了上述有益细菌属丰度，有利于改善土壤微生态环境，减少植物病害，促进烟草生长发育。然而，本研究发现轮作烟田（R_75）显著降低了有益真菌木霉菌属、青霉菌属和被孢霉属的丰度。木霉菌和青霉菌均可产生细胞壁降解酶和多种抑菌活性物质抑制病原菌的生长（Silva et al.，2019；Zhao et al.，2021），被孢霉属可有效减轻植物根结线虫病（DiLegge et al.，2019）。方宇等（2022）的研究结果表明上述3种有益真菌属在感染黑胫病的烟草（HJTY）丰度高于健康烟草（ZCTY），本研究结果与之一致，推测可能是C_75患病烟草为阻止黑胫病菌的进一步侵染而招募了土壤中的有益真菌，也可能是R_75土壤中的拮抗细菌在抑制病原真菌的同时也抑制了有益真菌（任海英等，2021）。微生物属水平差异显著性分析结果表明，轮作烟田中多种有益细菌属丰度上升，多种有益真菌属丰度下降，推测烟荞轮作主要通过对烟草根际有益细菌群落的调控增加烟草对黑胫病的抗病能力。

4 结论

烟荞轮作可有效降低田间烟草黑胫病病情指数和根际黑胫病菌数量，提高烟草根际真菌和细菌的群落丰富度和多样性，增加烟草根际多种有益菌的丰度，对改善土壤微生态环境、缓解连作障碍具有积极作用。烟荞轮作可安全有效防治烟草黑胫病，具有较广的推广应用前景。