T2DM患者miR⁃377、VEGF及8⁃iso⁃PGF2α水平与肾损伤的相关性

范艳艳 吕莎莎 耿金平

目前我国糖尿病患者以2 型糖尿病（type 2 dia⁃betes mellitus，T2DM）为主，由微血管病变引发的糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy，DN）是T2DM最严重并发症之一，严重影响患者预后，因此，预测肾损伤发生对T2DM 患者有重要的临床意义［1⁃2］。微小RNA（microRNA，miRNA）参与代谢和细胞凋亡等多个生物过程。既往研究表明，DN 患者体内异常表达的miRNAs 可能与其发生、发展和转归有所关联，因此差异化表达的miRNAs 水平有望成为早期诊断糖尿病患者肾功能损伤的生物学指标，进一步推进临床DN 治疗［3］。血管内皮生长因子（vas⁃cular endothelial growth factor，VEGF）可以促进血管内皮细胞增殖，提高血管通透性，miRNA 通过调节VEGF 表达调控血管生成，影响疾病进展［4］。8⁃异前列腺素F2α（8⁃isoprostaglandin F2α，8⁃iso⁃PGF2α）是评价机体氧化应激反应的特征指标，尿β2⁃微球蛋白（β2⁃microglobulin，β2⁃MG）常被用作早期诊断肾损伤的特异性指标，胱抑素C（Cystatin C，Cys⁃C）是评价肾小球过滤功能的指标［5⁃6］。本研究将通过分析上述指标与T2DM 患者肾损害相关性及对肾损伤发生的预测价值，以期为临床早期诊断T2DM 患者肾损伤提供参考。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2019年1 到2020年10月廊坊市中医医院收治的200 例2 型糖尿病患者。纳入标准：①根据中华医学会糖尿病学分会制定的相关标准［7］确诊为T2DM：有典型糖尿病症状，空腹血糖≥7.0 mmol/L或随机血糖≥11.1 mmol/L；或无典型糖尿病症状，连续两次空腹血糖≥7.0 mmol/L 或餐后2 h 血糖≥11.1 mmol/L 或连续两次随机血糖≥11.1 mmol/L。②年龄35～75 岁。排除标准：①有家族糖尿病史或患有1 型糖尿病；②其他基础肾脏疾病；③合并严重感染后恶性肿瘤；④近期经历大手术；⑤临床资料不完整。根据糖尿病肾损伤相关诊断标准［8］，取24 h 尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion rate，UAER）水平三次测量平均值，UAER=30～300 mg/24 h 定义为肾损伤，UAER≤30 mg/24 h 定义为肾未损伤，将患者分为肾损害组62 例（n=62）和非肾损害组138 例（n=138）。本研究经院医学伦理委员会批准通过，受试者已签署知情同意书。

1.2 观察指标与检测方法

记录两组研究对象年龄、性别、空腹血糖和病程等一般资料。

1.2.1 基础指标

采集所有研究对象清晨空腹静脉血及晨尿各5 mL，向血液样本中加入肝素钠抗凝，将血液和尿液样本离心（3 500 r/min，r=10 cm，10 min），取上清液，采用免疫比浊法检测血浆Cys⁃C、C 反应蛋白（C⁃reactive protein，CRP）水平和尿β2⁃MG 水平，采用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosor⁃bent assay，ELISA）检测血浆8⁃iso⁃PGF2α 和VEGF水平；采用脲酶电极法检测血尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）水平；采用苦味酸法检测血肌酐（Serum Creatinine，Scr）水平。所有试剂盒均购自上海臻科生物科技有限公司。

1.2.2 血清miR⁃377 表达水平

采集所有患者清晨空腹静脉血5 mL，离心（3 500 r/min，r=10 cm，10 min）取上清，加入Trizol提取总RNA，使用逆转录试剂盒（北京泰泽嘉业科技发展有限公司）将RNA 逆转录为cDNA，以cDNA为模板，按PCR 扩增试剂盒（杭州昊鑫生物科技股份有限公司）说明进行PCR 扩增，以GAPDH 为内参，实时荧光定量聚合酶链反应（Real⁃time fluores⁃cence quantitative polymerase chain reaction，qRT⁃PCR）检测血清miR⁃377 表达。miR⁃377 引物序列为：上游：5′⁃GTTTGTTTTAGGGTTATAGAAGTT⁃GG⁃3′，下游：5′⁃ATATAACCTTATTCAATCCAA CCTAC⁃3′；GAPDH 引物序 列为：上游：5′⁃GT⁃CAACGGATTTGGTCTGTATT⁃3′；下游：5′⁃AGT CTTCTGGGTGGCAGTGAT⁃3′。引物均由宝生物工程（大连）有限公司合成。PCR 反应体系：反应总体积15 μL，94℃预变性4 min、94℃变性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s，共45 个循环。重复实验3 次，取平均值，采用2⁃ΔΔCt法计算相对表达量。

1.3 统计学处理

采用SPSS 18.0 统计软件进行数据分析，计数资料用n（%）表示，采用χ2检验，计量资料采用（）表示，采用t检验；采用Pearson 分析血浆8⁃iso⁃PGF2α、VEGF 和血清miR⁃377 表达水平与T2DM患者肾损害的相关性；采用受试者工作特征（ROC）曲线分析血浆8⁃iso⁃PGF2α、VEGF 和血清miR⁃377 表达水平与T2DM 患者发生肾损害的预测价值。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者临床资料

两组研究对象性别、年龄、BMI 和病程等一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），肾损伤组患者CRP、Scr、BUN、Cys⁃C 和β2⁃MG 水平均明显高于非肾损伤组，白蛋白水平明显低于非肾损伤组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 肾损伤组和非肾损伤组患者临床资料［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of clinical data between damage group and non⁃damage group［n（%），（±s）］

表1 肾损伤组和非肾损伤组患者临床资料［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of clinical data between damage group and non⁃damage group［n（%），（±s）］

类别性别t/χ2值P 值男女BMI（kg/m2）年龄（岁）病程（年）白蛋白（g/L）CRP（mg/L）Scr（μmol/L）BUN（mmol/L）Cys⁃C（mg/L）β2⁃MG（mg/L）肾损伤组（n=62）32（51.61）30（48.39）23.16±2.01 56.78±8.67 8.28±2.12 23.86±7.44 10.38±3.31 348.58±48.63 16.91±3.66 2.17±0.67 0.19±0.08非肾损伤组（n=138）73（52.90）65（47.10）23.07±1.98 57.03±8.76 8.37±2.52 35.19±8.27 8.15±2.72 237.07±35.17 10.18±2.95 1.24±0.45 0.11±0.06 0.028 0.296 0.187 0.245 9.236 5.004 18.323 13.818 11.528 7.833 0.866 0.768 0.852 0.807<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

2.2 两组血浆VEGF、8⁃iso⁃PGF2α 及血清miR⁃377 表达水平比较

肾损伤组患者血浆VEGF、8⁃iso⁃PGF2α 及血清miR⁃377 表达水平均明显高于非肾损伤组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 两组血浆VEGF、8⁃iso⁃PGF2α 及血清miR⁃377 表达水平比较（±s）Table 2 Comparison on the expression levels of plasma VEGF，8⁃iso⁃PGF2α and serum miR⁃377 between 2 groups（±s）

表2 两组血浆VEGF、8⁃iso⁃PGF2α 及血清miR⁃377 表达水平比较（±s）Table 2 Comparison on the expression levels of plasma VEGF，8⁃iso⁃PGF2α and serum miR⁃377 between 2 groups（±s）

组别肾损伤组非肾损伤组t 值P 值n 62 138 VEGF（ng/mL）308.76±59.41 228.94±31.09 12.458<0.001 8⁃iso⁃PGF2α（ng/L）458.66±58.82 142.37±39.67 44.668<0.001 miR⁃377 1.42±0.18 0.97±0.12 20.841<0.001

2.3 血浆8⁃iso⁃PGF2α、VEGF 和血清miR⁃377 水平与T2DM 肾损害相关性分析

对T2DM 肾损害情况进行变量赋值，未发生肾损伤=0，发生肾损伤=1。Pearson 相关性分析显示，血浆VEGF、8⁃iso⁃PGF2α 及血清miR⁃377 表达水平与T2DM 患者肾损伤程度呈正相关（r=0.313、0.332、0.341，P<0.05）。

2.4 血浆8⁃iso⁃PGF2α、VEGF、血清miR⁃377 水平对T2DM 患者发生肾损害的预测价值

选择鉴别诊断肾损伤差异变量进行赋值，未发生肾损伤=0，发生肾损伤=1。血浆Cys⁃C、8⁃iso⁃PGF2α、尿β2⁃MG 联合检测鉴别诊断T2DM 肾损伤的AUC 为0.882（P<0.05）。见表3、图1。

表3 ROC 分析血浆8⁃iso⁃PGF2α、VEGF、血清miR⁃377水平及联合检测T2DM 肾损伤Table 3 ROC curves of plasma 8⁃iso⁃PGF2α，VEGF，serum miR⁃377 and combined detection in the diagnosis of renal damage in T2DM

图1 ROC 曲线图Figure 1 ROC curve

3 讨论

既往研究证明，Cys⁃C 参与调节细胞内蛋白质类化合物代谢，当肾小球滤过功能受损时，血中Cys⁃C水平迅速升高，随病情加重逐渐增高，由于其在肾损伤早期即发生变化，适用于肾损伤的早期诊断［9］。β2⁃MG 能自由透过肾小球滤过膜，当肾小球滤过功能受损时，尿液β2⁃MG 含量明显增加，是目前临床反映肾小球滤过功能早期诊断的重要指标［10］。Scr和BUN 是临床常用评价肾功能的指标，CRP 常用于炎症反应的诊断与鉴别。当糖尿病进展为DN 后，患者上述指标均有明显升高，提示临床可以通过观察这些指标的变化，对糖尿病患者发生肾功能损伤行初步预测。本研究结果，提示临床可以通过观察上述指标上来合理判断肾脏病变的发生。

当血糖升高，增多的自由基催化生物膜上的花生四烯酸发生脂质过氧化产生8⁃iso⁃PGF2α，促使单核细胞粘附在微血管内皮细胞上，造成组织损伤，其水平一定程度上反映机体氧化应激反应水平［11］。有研究显示，8⁃iso⁃PGF2α 水平在评估心血管疾病、糖尿病等方面具有重要价值，8⁃iso⁃PGF2α含量在糖尿病患者血液中和尿液中明显升高，与本研究结果一致［12］。DN 作为糖尿病微血管并发症，与VEGF 的表达密切相关。研究表明，VEGF 在DN 患者肾小球足细胞中持续表达，足细胞分泌的VEGF 与内皮细胞上的VEGF 受体结合，使血管通透性增加，改变肾小球滤过膜的通透性，加重肾功能损伤［13］。Wang 等［14］指出，高糖状态下人系膜细胞中miR⁃377 表达明显上调，并与DN 进展密切相关，其调控机制是通过增加纤连蛋白表达，造成肾小球细胞外基质沉淀。另有研究显示，早期糖尿病患者尿液中出现miR⁃377 高表达，进一步说明miR⁃377 可能参与DN 的发生与发展［15］。miR⁃377 通过调控靶基因表达，调控相关信号通路，进而参与多种疾病进展。转化生长因子TGF⁃β/SMAD 信号通路与DN 的发生与发展有密切关联，SMAD 蛋白可诱导肾小球硬化和肾间质纤维化，是DN 发展的重要原因。miR⁃377 通过调控该信号通路，上调SMAD 蛋白表达，进一步加重T2DM 患者肾功能损伤，同时miRNA 在血液中保持稳定的优点使其成为DN 预测与评估的优质指标。本研究结果提示对三个指标进行及时检测对T2DM 患者是否发生肾损伤及预测其损伤程度有一定应用价值。

Pearson 相关性分析显示，血浆VEGF、8⁃iso⁃PGF2α 及血清miR⁃377 表达水平与T2DM 患者肾损伤程度呈正相关，即当上述指标表达水平升高时，患者肾损伤程度越高，且偏离正常水平越多标志患者肾损伤程度越高。血浆VEGF、8⁃iso⁃PGF2α、血清miR⁃377 表达水平及联合检测鉴别诊断T2DM 肾损伤的AUC 分别为0.781、0.767、0.770、0.882，说明三者在早期鉴别诊断T2DM 患者发生肾损伤方面有较高的检测价值，当三者联合检测时，敏感度大大增加，提示临床可以同时联合三种指标检测综合判断T2DM 发生肾损伤的可能性。

综上所述，血浆VEGF、8⁃iso⁃PGF2α、血清miR⁃377 表达水平与肾损伤明显相关，当肾脏发生器质性损伤时，三者水平均会明显升高，能够提示肾损伤程度，由于三者具有稳定、高效、敏感、特异性高等特点，有望成为临床诊断T2DM 患者发生肾损伤的有效手段。