西葫芦CCD基因家族鉴定及其在果实发育中的表达

陈敏氡，王 彬，李永平，刘建汀，裘波音，朱海生

(福建省农业科学院 作物研究所，福建省蔬菜遗传育种重点实验室，福州 350013)

类胡萝卜素是一类广泛存在于生物界中的重要色素总称。在高等植物中，类胡萝卜素通过类胡萝卜素裂解双加氧酶(carotenoid cleavage dioxygenase, CCD)裂解生成的脱辅基类胡萝卜素及其衍生物，在影响农作物香气，调控植株生长发育，参与植物激素ABA形成等方面具有重要调控作用[1]。CCD是一类非血红素铁酶，含有保守结构域RPE65(视网膜色素上皮特异性蛋白65，retinal pigment epithelial membrane protein)[2]。依据底物是否含有环氧结构，可将其分为类胡萝卜素裂解双加氧酶(CCDs)和9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCEDs)[3-4]。

目前，在植物中发现的CCD家族成员共有12个，包括5个CCD亚家族(CCD1、CCD2、CCD4、CCD7和CCD8)和7个NCED亚家族(NCED1、NCED2、NCED3、NCED4、NCED5、NCED6和NCED9)。不同CCD家族成员在植物中发挥的作用各不相同[5]。CCD1基因能够裂解β-隐黄质、玉米黄质、紫黄质等类胡萝卜素9′-10′位置的双键，形成紫罗兰酮、香叶基丙酮和假紫罗兰酮等芳香类物质，对植物香气的形成具有重要调控作用[6]。研究发现，CCD1是控制杏[7]、烟草[8]等香气物质形成的关键基因。CCD2是在藏红花属(CrocMs)植物中新发现的一个CCD家族基因，主要参与花香和花色物质(如藏花酸)的形成[9]。研究显示，藏红花CCD2基因的过表达会使其花被片、柱头呈现黄色、橙色以及红色[10]。近年来有研究显示，在栀子的转录组数据中并未发现CCD2基因，推测栀子中参与藏花素合成的CCD基因可能不是CCD2基因，而是CCD4基因[11]。CCD4也在植物着色以及香气物质的合成过程中发挥重要作用[12]。在金银花[13]、百合[14]等植物中，CCD4是控制花器官呈现黄色或白色的关键基因。在西葫芦中CCD4被发现参与果实着色调控[15]。CCD7 和CCD8 主要参与植物激素独角金内酯的调控[16-17]。研究发现，CCD7和CCD8的表达差异会影响独脚金内酯的合成，进而影响植物的发育。在土豆[18]、番茄[19]和水稻[20]等多种植物中，CCD7或CCD8被证实参与调控植物衰老、根的生长、分蘖以及花器官的发育等多种生命过程。NCED是植物脱落酸(abscisic acid, ABA)合成的限速酶，对植物抗逆性具有重要作用[21]。过量表达NCED基因不仅可以增加内源ABA的积累，还可以提高植株的干旱忍耐力[22]，此外，NCED还对植株的形态特征和光合作用产生影响[23]。

西葫芦为葫芦科(Cucurbitaceae)南瓜属一年蔓生草本植物，是中国冬春季节设施栽培重要的瓜类蔬菜之一。迄今，西葫芦中已克隆到了2个CCD基因，均为NCED亚家族基因。研究发现，这2个基因分别参与西葫芦的果实发育过程，且受干旱诱导后显著高表达，表明CCD基因在西葫芦的生长发育及应对逆境胁迫过程起着调节作用。目前对西葫芦CCD基因家族未见系统的报道，尤其是CCD亚家族基因。本研究基于已公布的西葫芦全基因组数据，对西葫芦CCD基因家族成员进行鉴定，并对该家族成员的理化性质、染色体定位、基因结构、保守基序、系统进化、顺式元件以及共线性等进行分析，继而研究CCD基因在西葫芦不同组织及果实发育过程中的表达模式，为后续解析CCD基因家族在西葫芦中的功能提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验以西葫芦品种‘401’为材料，于2021年6月在福建省农业科学院作物研究所东张基地，分别采集子房授粉后3、5、7和20 d的西葫芦果实，选择无病虫害、无机械损伤、大小一致、果形均匀的果实，每个样品3个重复。采后将所有样品液氮速冻，置于-80 ℃保存备用。

1.2 西葫芦CCD基因家族的鉴定

参照已报道的9个拟南芥CCD蛋白序列，对西葫芦的蛋白序列进行本地Blast，得到候选的西葫芦CCD蛋白序列，接着提交到在线软件SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)和在线工具CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)进行蛋白结构预测，删除不包含RPE65结构域的序列，最终得到西葫芦CCD家族基因。依据拟南芥中同源基因进行命名，将没有同源基因的命名为CpCCD-like，同一个亚家族内的基因根据染色体上的位置按照小写字母依次排序。西葫芦全基因组数据、蛋白序列和注释文件从CuGenDB数据库(http://cucurbitgenomics.org/)中下载, 拟南芥CCD基因序列和蛋白序列从NCBI中下载。

1.3 西葫芦CCD基因家族的生物信息学分析

利用ExPASy(https://www.expasy.org/)和在线工具SMS (http://www.bio-soft.net/sms/index.html)分析西葫芦CCD蛋白的理化性质。利用在线工具CDD分析CCD基因中RPE65结构域的位置。利用WoLF PSORT (http://wolfpsort.org)预测亚细胞定位情况。利用TBtools软件工具制作西葫芦CCD基因家族的染色体定位图。利用在线软件MEME(http://meme-suite.org/)分析CCD蛋白序列的保守基序(Motif)。利用在线软件GSDS(http://gsds. cbi.pku.edu.cn/)制作基因结构图。利用MEGA 7.0软件构建西葫芦、拟南芥和番茄CCD蛋白系统进化树，并使用在线工具Evolview(https://www.evolgenius.info/evolview/)对进化树进行美化和可视化。利用Plant CARE 数据库(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/)分析顺式作用元件的种类、数目及功能。利用MCScanX软件检测西葫芦基因复制事件，并使用TBtools软件进行西葫芦CCD家族成员的共线性分析。

1.4 CCD基因家族的表达分析

1.4.1CCD基因在西葫芦不同组织的表达分析利用实验室前期已有的西葫芦不同组织(根、茎、叶、花和果实)高通量转录组数据，收集所有CCD家族基因在不同组织中的FPKM值，对转录组数据进行标准化处理，并利用TBtools软件绘制CCD基因家族成员在西葫芦不同组织中的表达热图。

1.4.2CCD基因在西葫芦不同果实发育时期的qRT-PCR分析采用通用植物总RNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取西葫芦不同发育时期(子房、授粉后3、5、7和20 d)果实总RNA, 将其作为模板，利用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)反转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)合成cDNA。利用Primer Premier 5软件设计定量引物，具体引物序列见表1，其中西葫芦EF-1a为内参基因。利用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ荧光定量试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)进行qRT-PCR分析，PCR反应体系为 cDNA 2 μL，2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ10 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，正、反向引物各0.8 μL和ddH2O 6 μL。扩增程序为95 ℃预变性30 s; 95 ℃变性5 s, 60 ℃退火34 s, 40个循环。每个处理3个重复, 并使用2-ΔΔCT方法计算基因的相对表达量，用Excel软件对数据进行作图。

表1 本研究所用实时荧光定量PCR引物Table 1 qRT-PCR primers used in this study

2 结果与分析

2.1 西葫芦CCD基因家族的鉴定与序列分析

从西葫芦基因组中共鉴定出13个CCD基因并进行命名，13个西葫芦CCD基因分布在9条染色体上，且分布不均匀，其中1号、12号、14 号染色体上分布较多(图1)。序列分析表明，13个西葫芦CCD基因编码的氨基酸数目介于420～590，分子量介于47.29～65.89 kDa，等电点介于5.67～8.44。13个CCD基因的RPE65结构域位置各不相同(表2)。亚细胞定位结果显示，西葫芦CCD基因家族成员均定位于叶绿体或细胞质(表2)。

表2 西葫芦基因组中鉴定到的CCD基因Table 2 The CCD genes identified in zucchini genome

2.2 西葫芦CCD基因家族的系统进化分析

选取9个拟南芥(Arabidopsisthaliana) CCD蛋白，10个番茄(Solanumlycopersicum)CCD蛋白和13个西葫芦CCD蛋白构建系统进化树(图2)，发现32个CCD 蛋白可分为 6个亚家族，分别为CCD1、CCD4、CCD7、CCD8、NCED、CCD1-like。CCD1、CCD4、CCD1_like和NCED亚家族之间具有更近的遗传距离，而与CCD8和CCD7亚家族的遗传距离较远。CCD家族蛋白具有较高的保守性，推测它们可能具有相似或相同的基因功能。

2.3 西葫芦CCD基因家族的保守基序(Motif)和基因结构分析

使用MEME工具在西葫芦CCD家族蛋白中找到了10个Motif(图3)。NCED亚组含有的Motif数量最多，为9～10个且种类基本相同；CCD各亚组间和组内所含Motif的种类与数量差异较大，其中CCD1和CCD4亚组含有的Motif数量最多，为7～9个，而CCD1-like和CCD7含有Motif数量最少，为3～4个。进一步分析西葫芦CCD家族各成员的基因结构(图4)发现，西葫芦CCD基因家族外显子数目为1～13个，内含子数目为0～12个；成员间结构存在较大的差异，其中CCD4和NCED亚家族基因结构较简单，而CCD1和CCD1-like亚家族基因的结构复杂。

2.4 西葫芦CCD基因家族的共线性分析

为进一步探索西葫芦CCD家族基因的进化过程，本研究分析了CCD家族不同基因间的共线性关系，共发现5对CCD基因存在共线性关系(图5)，分别为CpCCD4b和CpCCD4a、CpCCD8a和CpCCD8b、CpNCED3a和CpNCED3b、CpNCED5a和CpNCED5b、CpNCED5a和CpNCED9。这5对共线性的基因对中包括了4对同源基因，每对同源基因对分布在不同的染色体上，说明该家族在进化过程中发生了染色体片段复制事件。

2.5 西葫芦CCD基因家族启动子顺式作用元件分析

进一步分析了西葫芦CCD基因家族的启动子区域(图6)。结果表明，CCD基因家族的每个成员都含有大量的光信号响应元件，如G-box、GT1-Motif、TCT-Motif等，表明西葫芦CCD家族基因具有光诱导的特性。大多数CCD家族成员含有激素以及环境胁迫响应元件，如生长素响应元件(TGA、TGA-box)、脱落酸响应元件(ABRE)、赤霉素响应元件(GARE-Motif、P-box、TATC-box)、茉莉酸甲酯响应元件(CGTCA-Motif、TGACG-Motif)、水杨酸响应元件(TCA)、干旱响应元件(MBS)、低温响应元件(LTR)、防御胁迫响应元件(TC-rich repeats)和抗氧化响应元件(ARE)，推测西葫芦CCD家族基因可能参与响应激素调控及抵御干旱、低温等胁迫过程。除此之外，还发现少部分CCD基因含有响应生长发育相关元件，如调控昼夜节律响应元件(Circadian)、调控胚乳响应元件(GCN4-Motif)以及调控种子萌发响应元件(RY)，暗示CCD基因也参与植物的生长发育过程。

2.6 西葫芦CCD基因家族的组织表达特性分析

根据前期获得的西葫芦不同组织的转录组数据，CCD家族成员在西葫芦根、茎、叶、花和果实等5个组织中的表达见图7。以FPKM值>1作为基因表达的筛选标准，发现其中3个基因(CpCCD8b、CpNCED5a和CpNCED6)在所有组织中的FPKM数值均小于1，可以认为它们在组织中不表达。余下的10个基因中，CpCCD1、CpCCD4a、CpCCD4b和CpCCD8a4个基因在所有组织中均有表达且表达量高，其中CpCCD1基因在叶和果实中显著高表达(FPKM值>100)，提示该基因可能参与调控叶和果实的发育调控；其他6个基因表达量低，且部分基因在一些组织中不表达，其中CpCCD7和CpNCED9分别只在根和花中特异表达。

2.7 西葫芦CCD家族基因在不同发育时期果实中的qRT-PCR分析

进一步分析了10个CCD基因 (CpCCD1、CpCCD4a、CpCCD4b、CpCCD8a、CpCCD1-like、CpNCED3b、CpNCED3a、CpNCED5a、CpNCED9和CpCCD7)在西葫芦果实不同发育时期(子房以及授粉后3、5、7和20 d)的表达规律(图8)。结果显示，8个CCD基因(CpCCD1、CpCCD4a、CpCCD4b、CpCCD8a、CpNCED3b、CpNCED3a、CpNCED5a和CpCCD7)在果实发育过程中呈现上调表达，2个CCD基因(CpCCD1-like和CpNCED9)在果实发育过程中呈现下调表达，其中CpCCD1、CpCCD4a、CpCCD4b、CpCCD8a这4个CCD基因在果实膨大生长期或成熟期出现显著高表达。CpCCD8a基因在授粉后3 d表达量显著升高(P<0.05)，之后一直维持高表达，到授粉20 d果实中的表达量再次显著升高(P<0.05)；CpCCD4a在授粉后5 和7 d表达量出现显著升高(P<0.05)，之后在20 d再次显著升高至最大值；CpCCD4b和CpCCD1在授粉后前5 d表达量较低，到授粉后7 和20 d表达量分别出现两次显著升高(P<0.05)，推测它们可能在西葫芦果实生长发育过程中具有重要的调控作用。

3 讨 论

CCD基因在高等植物中数量不一。拟南芥基因组中有9个CCD基因[3]，金银花中有7个CCD基因[13]，烟草中有19个CCD基因[24]。本研究从西葫芦基因组中获得了13个CCD基因。研究发现不同物种间CCD成员数量差异主要表现在CCD4亚家族上，张亚飞等[25]认为这是该基因在进化过程中发生了基因扩增事件。除此之外，由于CCD4与植物果肉、花器官的着色密切相关，因此，颜色丰富的作物通常含有的CCD4成员也多。西葫芦种质颜色多样，有黄色、绿色和白色等。本研究在西葫芦果实中鉴定到了2个CCD4基因，也印证了这个现象。在13个西葫芦CCD基因中共发现4个基因对，占家族成员总数的60%以上，与张亚飞[25]、徐胤[26]等在柑橘、毛竹中的研究结果类似，提示CCD基因家族在进化过程中可能发生大量的复制现象，导致基因数量的扩增。共线性结果显示这4个基因对均存在着共线性关系，而且单个基因还对应多个基因，推测它们可能具有相似或相同的基因功能。本研究对拟南芥、番茄和西葫芦共 32个CCD蛋白的系统进化树分析表明，CCD家族蛋白可分为CCD1、CCD4、CCD7、CCD8、NCED、CCD1-like 6个亚组，其中CCD1、CCD4、CCD1-like 和NCED亚家族之间的遗传距离更近，表明它们彼此间的亲缘关系更近。一般而言，同一基因家族亲缘关系较近的基因，它们的基因结构也相似[27-28]。本研究中，西葫芦CCD4和NCED亚家族内的基因结构相近且较简单，除CpNCED9和CpCCD4a含1个内含子外，其他成员均不含内含子，这与柑橘CCD4和NCED亚家族基因的结构特点一致[25]。

本研究根据西葫芦不同组织的转录组数据，分析了CCD家族成员的组织表达模式，结果显示CCD家族成员具有组织表达特异性，这与束红梅等[29]在西红花上研究结果一致。其中CpCCD1基因在叶和果实中显著高表达(FPKM值>100)，提示该基因可能参与调控叶和果实的发育调控。进一步分析了10个CCD基因在西葫芦果实不同发育时期的表达规律，结果显示，在果实发育过程中，8个CCD基因呈现上调表达，2个CCD基因呈现下调表达，其中CpCCD1、CpCCD4a、CpCCD4b、CpCCD8a这4个CCD基因在果实膨大生长期或成熟期出现显著高表达，由此推测这4个CCD基因可能在西葫芦果实发育过程中发挥调控作用。目前，已有文献证实CCD4基因参与了西葫芦果实发育过程中类胡萝卜素的调控。Gonzalez-verdejo等[30]发现CpCCD4基因成员是调节西葫芦果实中类胡萝卜素含量的最重要基因，它们在果实类胡萝卜素含量的降解过程中起重要作用。CCD1基因也在多种作物中被发现与果实发育密切相关。张印等[31]发现CCD1基因抑制表达后，柑橘果实中紫黄质、9-顺式-紫黄质的含量显著增加。刘盛雨等[7]研究显示PaCCD1是控制杏果实脱辅基类胡萝卜素类香气物质形成的关键基因。梁乘榜等[8]发现CCD1基因参与了枇杷果实着色的调节。CCD8在植物果实发育方面的研究相对较少，它的主要功能是参与独角金内酯的合成。独脚金内酯是一种新型的植物激素，在调节植物分枝生长、根系发育及根瘤菌形成中发挥重要作用。由于独脚金内酯可以诱导危害较大的列当属种子萌发，因此，在番茄[32]、马铃薯[18]中会利用沉默CCD8基因表达，阻止独脚金内酯的合成，从而降低列当种子的萌发率。本研究中，CpCCD8a在授粉后3 d一直处于高表达，说明它们在西葫芦果实发育的中后期产生作用，而具体的作用机制仍需探究。最近，辽宁石油化工大学有项研究显示，在手捻葫芦雌花形成后定期喷施1.8 ～5.5 μmol/L的独脚金内酯于雌花基部以及完成授粉后的果实部位，可以调节果实木质化进程，使手捻葫芦上下部木质化时间分离，从而有利于优化果实形状提高品质。因此，在今后研究中可以探索西葫芦中是否含有独脚金内酯，且CpCCD8a是否参与独脚金内酯的合成，以及它与果实木质化的关系。

综上，本研究提供了西葫芦CCD基因家族的完整信息，并明确了CCD家族基因在西葫芦不同组织及果实发育过程中的表达模式，为后续解析CCD基因家族在西葫芦中的功能奠定了基础。