中国西南地区新生儿高胆红素血症基因多态性研究

刘 玲 蒋榆辉 聂潘荣 曾丽梅 段改原 李宇晨

1.昆明市儿童医院（云南昆明 650103）；2.云南大学附属医院（云南昆明 650021）；3.云南省保山市人民医院（云南保山 678099）；4.景洪市第一人民医院（云南西双版纳州 666100）；5.昆明医科大学（云南昆明 650500）

新生儿高胆红素血症是新生儿期的常见疾病，对不同人群的调查发现，约40.0%～80.0%的新生儿可出现不同程度黄疸[1]。对于大多数新生儿来说，黄疸是一个常见的生理现象。遗传和环境是影响新生儿高胆红素血症发生的重要因素[2-4]，遗传因素与临床的相关性受到更多关注[5-7]。有报道提出，足月新生儿血清非结合胆红素的峰值水平和核黄疸的发生率，印第安人和黄种人均高于白种人和黑种人[8]。与新生儿高胆红素血症相关的基因变异包括：①尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1 A1（uridine diphosphate-glucuronosyl transferase 1A1，UGT 1 A 1）启动和编码序列基因变异，该基因编码序列的变异可导致尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGT）结构异常，出现酶结合功能的缺陷或丧失，而启动序列（非编码序列）核苷酸的多态性则导致该酶表达能力下降引起酶活性降低，可见无论编码区及启动序列的基因变异均可使非结合胆红素在体内蓄积，从而造成新生儿黄疸，是该疾病发生发展的高危因素[8-10]。②SLCO 1 B 1基因变异，SLCO 1 B 1是有机阴离子转运蛋白家族成员1B1（organic anion transporter family member 1B1，OATP1B1）的编码基因，OATP 1 B 1 是肝细胞窦状隙膜和胆管侧膜上的转运体，是胆盐和胆红素的载体，在肝摄取过程中发挥着至关重要的作用，转运体基因发生变异引起的功能下降或缺失与肝脏多种疾病的发生休戚相关[11-15]。③葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）基因变异，G6PD基因变异可能破坏酶的功能，临床上主要表现为有或没有诱因的急性溶血，并导致高胆红素血症[16-18]。本研究的主要目的是确定UGT 1 A 1、SLCO 1 B 1和G 6 PD基因的变异和多态性与中国西南地区新生儿高胆红素血症的易感关联性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2016 年9 月至2019 年12 月在昆明市儿童医院、云南大学附属医院、云南保山市人民医院新生儿病房住院的新生儿高胆红素血症患儿的临床资料。纳入标准：①籍贯为中国西南地区，包括云南省、贵州省、四川省；②日龄＜28 d；③胎龄37～42周，出生体重≥2 500 g；④未使用过影响胆红素代谢的药物，如水杨酸类、磺胺等；⑤符合2004 年美国儿科学会推荐高胆红素血症的诊断标准[4]，即小时特异性血清胆红素值达到或超过新生儿小时胆红素列线图的第95 百分位数。排除标准：①母婴血型不合溶血病；②红细胞相关疾病引起的溶血病；③感染；④甲状腺功能异常；⑤存在明确血管外溶血；⑥红细胞增多症；⑦先天畸形；⑧遗传代谢性疾病，染色体异常。

从同期住院的血清胆红素水平低于2004年美国儿科学会推荐的新生儿小时胆红素列线图第40 百分位数的新生儿中，符合纳入标准①～④以及排除标准①～⑧，经家长同意并签署知情同意书后，招募200例新生儿作为对照组。

本研究获得昆明市儿童医院医学伦理委员会批准（伦理批号：2016-03-024-K01）以及家属知情同意。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 包括性别、胎龄、体重、日龄、开奶时间、分娩方式和红细胞压积。

1.2.2 标本采集 新生儿入院当日抽取2mL外周静脉血，采用日立7600全自动生化分析仪进行血清总胆红素和结合胆红素测定。

1.2.3 基因多态性检测 ①采用Wizard Genomic DNA purification Kit 试剂盒，提取血样中的DNA，-20 ℃储存备用；②使用Genotyping Tools 及MassARRAY Assay Design软件设计待测SNP位点的扩增引物及单碱基延伸引物；③提取PCR 产物、单碱基延伸获得PCR产物；④采用树脂纯化延伸产物后点样SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF分析，检测结果使用TYPER 4.0软件（sequenom）分型并输出结果。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.5 统计软件进行数据分析。计量资料符合正态分布的以均数±标准差表示，两组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布的以M（P25～P75）表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验。计数资料以例数（百分比）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher精确概率法检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病例组与对照组临床特征比较

符合纳入标准的新生儿高胆红素血症患儿203例，排除13 例，其中病历资料不完整3 例，DNA 提取失败6例，家长因各种原因签字出院4例，最终共纳入190 例（病例组）。男98 例、女92 例，平均胎龄（38.7±1.2）周。对照组200例，男116例、女84例，平均胎龄（38.9±1.3）周。两组患儿总胆红素及结合胆红素差异均有统计学意义（P＜0.05）；而性别、胎龄、出生体重、日龄、开奶时间、分娩方式、红细胞压积比较差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。见表1。

表1 病例组与对照组间临床特征比较

2.2 UGT 1 A 1 基因多态性与新生儿高胆红素血症相关性分析

对UGT 1 A 1基因rs 34993780、rs 873478、rs 34946978、rs 4148323 和rs 35350960 共5 个SNP 位点进行了分型检测（图1）。研究结果显示，rs 34993780 及 rs 35350960 两个位点在病例组和对照组中均只检出杂合变异基因型，且与本地区新生儿高胆红素血症的发生无显著相关性（P＞0.05）。rs 873478 位点基因型（GG、CG 和CC）及 rs 34946978 位点基因型（CC、TC 和TT）在两组间的分布差异均无统计学意义（P＞0.05），但等位基因C 和T 在病例组中的检出率均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。rs4148323位点基因型（GG、GA和AA）在两组间的分布差异有统计学意义（P＜0.05），病例组AA基因型频率较高；同时，病例组等位基因A 检出率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 病例组与对照组间UGT1A1基因型、等位基因频率分布比较[n (%)]

图1 UGT1A1 rs34993780、rs873478、rs34946978、rs4148323、rs35350960 位点分布图

2.3 SLCO1B1基因多态性与新生儿高胆红素血症相关性分析

对SLCO 1 B 1基因rs 59502379、rs 56101265、rs72559748、rs72559745、rs56061388、rs55901008、rs 4149056、rs 56199088 共8 个SNP 位点进行了分型检测（图2），其中rs 59502379、rs 56101265、rs72559745、rs56061388、rs55901008和rs56199088位点在病例组和对照组中均未检出多态性。rs72559748位点AG基因型及G等位基因在病例组中的检出率均显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

图2 SLCO1B1 rs59502379、rs56101265、rs72559748、rs72559745、rs56061388、rs55901008、rs4149056、rs56199088 位点分布图

表3 病例组与对照组间SLCO1B1基因型、等位基因频率分布比较[n (%)]

2.4 G6PD基因变异检出情况

G6PD基因rs137852328、rs1050828、rs7255664位点分型检测结果见图3。仅病例组中2例男性患儿检出rs72554664位点变异，检出率为1.1%（2/190），对照组均为野生型，其基因型及等位基因频率在两组间的差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表4。rs 137852328、rs 1050828 位点在病例组和对照组中均未检出多态性。

图3 G6PD rs137852328、rs1050828、rs7255664 位点分布图

表4 病例组与对照组间G6PD基因型、等位基因频率分布比较[n (%)]

2.5 风险等位基因个数与新生儿高胆红素血症发生相关性

为探讨风险等位基因个数与新生儿高胆红素血症风险程度的关联性，纳入上述3 个与新生儿高胆红素血症发生风险显著相关的位点进行分析，即UGT1A1基因rs873478、rs34946978和rs4148323。病例组和对照组之间风险等位基因个数分布差异有统计学意义（P＜0.05），病例组风险等位基因≥2个的比例较高。见表5。

表5 病例组和对照组间风险等位基因个数分布比较 [n (%)]

3 讨论

新生儿高胆红素血症的发病机制往往是多因素的，目前普遍认为遗传和环境因素共同参与高胆红素血症的发生、发展。

本研究通过对我国西南地区高胆红素血症新生儿及非高胆红素血症对照新生儿进行SNP位点分型检测，发现UGT 1 A 1基因rs 873478、rs 34946978和rs 4148323 位点与该地区新生儿高胆红素血症发生风险显著相关，这与既往研究一致[19-21]。此外，功能研究也发现，rs 34946978 和rs 4148323 位点杂合变异均可使酶活性降至正常的60.0%左右，而纯合变异则会降至32.0%～36.0%[22]。而rs873478位点位于近端启动子区域，可能参与基因表达调控或与TATA 盒产生连锁效应[23]。另外，尽管rs 34993780位点杂合和纯合变异可分别使酶活性下降至正常水平的27.6%和7.6%[22]，但本研究并未发现该位点与西南地区新生儿高胆红素血症的发生存在显著关联，这可能与其在本地区的等位基因频率偏低有关，仅5例高胆红素血症患儿（2.6%）和1例对照组新生儿（0.5%）检测到杂合变异，而纯合变异在两组中均未检出。由于本次研究是针对血清总胆红素值达到或超过新生儿小时胆红素列线图的第95百分位数和低于第40百分位的患儿进行变异位点基因型和等位基因频率的研究，具有一定的局限性，今后可纳入不同百分位血清总胆红素值的患儿参与研究，从而探讨以上变异位点基因型、等位基因分布频率与高胆红素血症严重程度是否存在关联性。

近年来SLCO 1 B 1基因多态性与新生儿高胆红素血症之间的关系逐渐成为研究热点，但国内外不同地区的研究存在较大差异。本研究未发现SLCO 1 B 1基因多态性与西南地区新生儿高胆红素血症发病风险增加有关，这与笔者团队既往在单一云南籍新生儿中开展的一项研究结论一致[24]。同一位点基因变异情况及其与新生儿高胆红素血症的关系在不同种族、不同地区中存在差异，这可能是环境和遗传因素共同作用的结果。值得注意的是，本研究发现，SLCO 1 B 1基因rs 72559748 位点多态性在对照组新生儿中的检出率显著高于病例组，提示该位点变异可能为新生儿高胆红素血症发生的保护因素，但具体机制尚有待于进一步研究证实。

G6PD酶活性缺乏常见的临床症状之一是新生儿高胆红素血症。流行病学研究结果显示，国外黑人、南欧、希腊、犹太、东南亚及阿拉伯人患病率较高，国内的患病率为0.2%～44.8%[25]，其中云南省、贵州省、四川省G6PD缺乏症的发病率分别为0.3%、0.5%和0.3%[26]，但在本研究中仅有2例高胆红素血症患儿中检出G6PD基因rs72554664位点变异，检出率为1.1%，考虑G6PD缺乏症可能不是西南地区新生儿高胆红素血症的主要风险因素。不过，也有文献报道云南省部分地区傣族新生儿高胆红素血症中G6PD缺乏症的发病率可高达 20.0%[27]。但由于本次纳入标准的研究对象主要是汉族，因此变异率较低，接下来项目组计划针对傣族新生儿高胆红素血开展专项研究，探索导致傣族新生儿高胆红素血症的主要变异基因以及这些变异位点是否存在协同性。

综上，本研究通过分析UGT1A1、SLCO1B1及G6PD基因17个多态性位点在我国西南地区新生儿中的分布情况，明确了该地区新生儿高胆红素血症发生的部分遗传风险因素，对疾病的诊治和防控有一定的意义，后续将进一步研究探讨导致新生儿高胆红素血症的主要基因的多态性在不同少数民族人群之间存在的差异性。