肥料中12种植物生长调节剂测定方法研究

王小雨，马小东，吴 凡

（黑龙江省质量监督检测研究院，黑龙江 哈尔滨 150028）

植物生长调节剂是人工合成的（或从微生物中提取的）具有和天然植物激素相似生长发育调节作用的有机化合物［1-2］。我国从20世纪50年代开始生产和应用植物生长调节剂，近50 年来人工合成的植物生长调节剂越来越多。我国对植物生长调节剂按照农药登记的要求进行管理，按照登记批准标签上标明的使用剂量、时期和方法使用植物生长调节剂一般不会危害人体健康。但如果使用不规范，也可能会造成农作物生长过快，或生长受到抑制，甚至死亡，从而影响农产品的品质。例如可以延长马铃薯、大蒜和洋葱等农产品贮藏期的青鲜素（抑制发芽）具有致癌作用。所以我国法律明文禁止销售、使用未经国家或省级有关部门批准的植物生长调节剂。若在肥料中添加植物生长调节剂，应与药肥的登记方式相同，即按照农药进行登记，但由于农药登记时间长、费用高，近年来一些不法厂商在肥料中违禁添加植物生长调节剂的现象屡见不鲜，影响肥料行业的健康发展。

目前行业标准对于植物生长调节剂的测定多为单一物质检测方法，而国家标准尚未对植物生长调节剂的检测方法做出规定。已有标准和文献中测定肥料中植物生长调节剂的常见方法为高效液相色谱法［3-7］，涵盖的植物生长调节剂种类不够多，同时高效液相色谱法一般采用紫外或者荧光检测器，存在样品前处理相对复杂、灵敏度不高、分离度不好等问题，而液相色谱串联三重四极杆检测器方法［8］，样品前处理简单，干扰少，灵敏度高，质谱响应可达10-9甚至10-12的水平。

综上所述，为了提高测定准确度和检测效率，笔者通过筛选色谱柱、改变梯度洗脱程序、考察基质效应等方式优化实验条件，并验证方法学数据，建立了超声提取-液相色谱串联三重四极杆（LCQQQ）同时测定4-硝基苯酚钠（PG-1）、5-硝基邻甲氧基苯酚钠（PG-2）、萘乙酸（PG-3）、脱落酸（PG-4）、赤霉酸（PG-5）、2,4D（PG-6）、吲哚-3-乙酸（PG-7）、吲哚丁酸（PG-8）、氯吡脲（PG-9）、烯效唑（PG-10）、多效唑（PG-11）、6-苄氨基嘌呤（PG-12）12种植物生长调节剂的检测方法。方法简单快捷、准确高效，为肥料中植物生长调节剂的检测和市场监管工作提供技术支持。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

SCIEX3500Q 型液相色谱-质谱联用仪（美国SCIEX 公司），配有TRIPLE QUADTM3500 质谱、ekspertTMultraLC 110 液相色谱、MultiQuantTM3.0.1 Software数据处理系统；色谱柱1，Eclipse Plus C18（美国安捷伦科技有限公司），5 μm，4.6 mm×150.0 mm；色谱柱2，ACQUITY UPOLC® BEH C18（沃特世公司），1.7 μm，2.1 mm×100.0 mm；离心机（德国SIGMA 公司）；BSA224S 型万分之一天平（德国Sartorius公司）；移液枪（德国艾本德股份公司），0.5 ～10.0、10 ～200、50 ～500、100 ～1 000 μL。

1.2 主要材料与试剂

PG-1至PG-12标准物质（998.7 ～1 001.6 mg/L，规格1 mL），德国Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司；甲醇，色谱纯，上海泰坦科技股份有限公司；甲酸，色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 标准溶液配制

1.3.1 标准储备液的制备

正离子标准储备液的制备：在10 mL带橡胶垫的广口玻璃瓶中加入甲醇9 920 μL，使用移液枪分别移取10 μL PG-1 至PG-8，得到质量浓度约为1 μg/mL的正离子标准储备液。

负离子标准储备液的制备：在10 mL带橡胶垫的广口玻璃瓶中加入甲醇9 960 μL，使用移液枪分别移取10 μL PG-9至PG-12，得到质量浓度约为1 μg/mL的负离子标准储备液。

负离子标准中间液的制备：在10 mL带橡胶垫的广口玻璃瓶中加入甲醇9 000 μL，使用移液枪移取1 000 μL负离子标准储备液，得到质量浓度约为0.1 μg/mL的负离子标准中间液。

1.3.2 标准工作溶液的制备

用甲醇稀释正离子标准储备液和负离子标准中间液，配制成PG-1 至PG-8 质量浓度为50、100、200、500、1 000 ng/mL，PG-9 至PG-12 质量浓度为5、10、20、50、100 ng/mL的标准工作溶液。

2 仪器工作条件

2.1 色谱条件

进样量为5 μL；柱温为40 ℃；流动相为体积分数0.1%的甲酸水溶液（A）和甲醇（B）；流速为0.8 mL/min。采用梯度洗脱，洗脱程序为0 ～1.5 min时，φ（B）为10%；1.5 ～3.0 min，φ（B）由10%增至60%；3.0 ～7.5 min 时，φ（B）由60%增至90%；7.5 ～9.0 min 时，φ（B）由90%降至10%；9.0 ～15.0 min时，φ（B）为10%。

2.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）温度550 ℃。正、负离子模式下气帘气压强分别为0.31、0.07 MPa，离子化电压（IS）分别为+5 500 V、-4 500 V，入口电压分别为10 V、-10 V，碰撞出口电压（CXP）分别为6 V、-6 V，喷雾气压强分别为0.48、0.48 MPa；辅助加热气压强分别为0.48、0.48 MPa；喷撞气压强分别为0.07、0.06 MPa；质谱参数见表1。

表1 质谱参数

2.3 样品溶液制备

称取肥料样品0.1 ～0.3 g（精确至0.1 mg）于离心管中，准确加入甲醇25 mL，涡旋1 min，于25 ℃超声波清洗器中超声30 min，6 000 r/min 离心5 min，取上清液过0.22 μm有机相滤膜，上机检测。

3 实验结果

3.1 色谱柱和梯度洗脱

分别采用色谱柱1 和色谱柱2 测试正离子和负离子模式下12种标准物质的出峰情况。使用色谱柱1分析正离子质量浓度为100 ng/mL，负离子质量浓度为10 ng/mL 的标准工作溶液，进样体积为10、5、2 μL 时，虽然随着进样量减少，正离子定量离子对的峰逐渐尖锐，但始终检测不到（347.5 kg/C）/（193.0 kg/C）、（347.5 kg/C）/（221.0 kg/C）的离子对，为了排除仪器检出限的影响，直接使用正离子质量浓度为1 000 ng/mL、负离子质量浓度为100 ng/mL的标准工作溶液测定，依然检测不到（347.5 kg/C）/（193.0 kg/C）、（347.5 kg/C）（221.0 kg/C）的离子对信号。负离子模式下，PG-9、PG-10、PG-11、PG-12 的离子峰随着进样量减少，钝化趋势减弱，但始终得不到平滑、尖锐、对称的峰。

使用色谱柱2分析正离子质量浓度为100 ng/mL，负离子质量浓度为10 ng/mL的标准工作溶液时，考察流动相A的初始体积分数由10%调整至90%，12种物质的出峰保留时间逐渐后移，在如2.1节所示的梯度洗脱条件时，得到了理想的总离子流图。每种物质实现了基线分离，展宽小，峰形尖锐，对称性好。

3.2 标准溶液的稳定性

配制好的标准工作溶液以不移动的方式（4 ℃的自动进样器中）保存，分别在2021 年12 月8 日、2021 年12 月13 日、2021 年12 月16 日 进 行 测 试，以PG-1（4-硝基苯酚钠）为例，峰面积、标准曲线的截距与斜率都没有发生明显变化，证明7 d 内低温保存可以保证标准工作溶液浓度水平的稳定，结果见表2、表3。另外11种物质与PG-1的趋势一致。

表2 不同保存日期下PG-1线性回归方程及相关系数

表3 不同保存日期下PG-1标准工作溶液峰面积

3.3 空白和干扰

为排除试剂和样品基体引入的干扰，在标准工作溶液相同条件下测甲醇试剂、去离子水及体积分数0.1%的甲酸水溶液的离子流图，几种试剂在目标物质的保留时间没有实质响应信号，对实验结果并不产生干扰。使用不含有待测物质的空白样品在标准曲线范围内（避开标准工作溶液浓度水平）由低到高选取4个均匀分布的浓度水平进行加标回收实验，平行测定2 次，结果见表4，加标回收率在91.15%～116.84%，说明样品的基质效应很弱。

表4 空白样品加标回收率数据

3.4 标准曲线和检出限

分别以12 种植物生长调节剂的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作标准曲线，得到线性回归方程（见表5）。以最低水平标准溶液3 倍信噪比和10 倍信噪比确定各化合物的检出限（LOD）和定量限（LOQ）。结果表明，12 种植物生长调节剂线性回归方程相关系数均大于0.998 3，方法线性良好，满足检测要求。

表5 线性回归方程

3.5 精密度和回收率

对含12 种植物生长调节剂的肥料样品，在与标准工作溶液相同测定条件下进行了8 次平行测定，考察实验方法和仪器设备的稳定程度，实验结果见表6。由表6 可知，该方法相对标准偏差在2.55%～8.98%。考察了该肥料样品3个浓度水平的加标回收率，每个样品平行测定2次，结果见表7。由表7 可知，样品的回收率在90.67% ～114.57%，满足检测需求。

表6 精密度实验结果（n=8）

表7 样品加标回收率实验结果

3.6 样品分析

使用建立的超声提取-液相色谱串联三重四级杆方法对尿素、有机-无机复混肥、生物有机肥、硫酸铵、氯化钾、有机肥料6类肥料的24个典型样品（每类4 个）中植物生长调节剂含量进行了测定。在有机肥料中检测到了4-硝基苯酚钠，质量浓度约为204.25 ng/mL，其他样品中12种目标物质的质量浓度均小于方法的定量限水平。说明流通领域的肥料样品对于植物生长调节剂的使用是比较安全的，没有出现随意使用的情况。

4 结论

建立了一种超声提取-液相色谱串联三重四极杆同时测定肥料中12 种植物生长调节剂的方法：与色谱柱1 相比，色谱柱2 在规定的仪器工作条件下更容易得到平滑、对称、尖锐的色谱峰；肥料本身的化学组成在2.3 节的处理条件下基质效应不足以对测定结果产生实质影响；标准工作溶液在4 ℃条件下比较稳定，7 d 内同一工作溶液响应信号无明显下降；方法的标准曲线、相关系数、精密度、回收率等方法学数据表现良好，能够满足肥料中植物生长调节剂的日常检测需求，为肥料中植物生长调节剂的检测及市场监管工作提供技术支持。