芒果采后炭疽病生防菌研究进展

赵 佳，童 凯，李 东，邓孟胜，雷 雨

（四川轻化工大学生物工程学院，四川 宜宾 644000）

素有“热带果王”美誉的芒果（Mangifera indica L.）因其风味独特、口感嫩滑、营养价值较高而深受消费者的喜爱。我国芒果种植主要分布在海南、广西、云南、四川、贵州等省区。据统计，2018 年我国芒果总产量226.81 万t，年产值超过100 亿元[1]。

芒果炭疽病是由炭疽菌属（Colletotrichum）真菌引起的，是芒果生产中发生面积最广、危害最严重的病害之一。研究发现，采后芒果果实的蒂部、中部和端部均可能潜伏一定数量的炭疽菌，炭疽菌多数在芒果果实发育期间侵入，随着采后果实抗性的降低和可利用营养物质的增加，病菌由潜伏状态转变为致病状态，引起果实出现圆形或近圆形、褐色或黑色凹陷的病斑，病斑轻则呈点状分布，重则连片发病，导致果实腐烂变质，丧失商品价值[2]。每年我国芒果采后损失高达20%～30%，而发达国家也达到15%左右[3]。

芒果采后炭疽病的防治以化学防治为主，生产者主要依赖甲基硫菌灵、多菌灵、苯醚甲环唑等合成杀菌剂控制芒果炭疽病。然而，合成杀菌剂处理过的芒果有农药残留且不易降解，易引发食品安全和环境问题，其中一些已被芒果国际贸易条约禁止[4]。生物防治因具有残留低、毒性小、无公害等优点，逐渐得到广泛应用[5]。生防菌是生物防治的有效手段之一，目前已经从植物和土壤中分离出许多具有拮抗作用的细菌、丝状真菌和酵母菌，这些微生物对芒果采后炭疽菌具有明显的抑制作用。本文对芒果采后炭疽病病原菌种类，主要生防菌的类别，病原菌的拮抗机制，以及如何增强生防菌的防治效果进行综述，以期为我国芒果采后炭疽病新型农药的制备与抗病资源的选育提供有价值的参考。

1 芒果炭疽病病原菌种类

20 世纪90 年代前，炭疽菌属真菌的分类主要依赖于形态学方法[6-9]。形态学鉴定是Sutton 在von Arx分类研究的基础上总结的一种传统分类方式，以纯培养条件下病原菌的菌落特征（颜色、质地和生长速率），分生孢子和附着孢的形态、大小，刚毛、菌核、厚垣孢子、有性型的有无及寄主范围等方面进行分类。通过形态学分类方法，芒果采后炭疽病病原菌多被鉴定为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（C.acutatum）[10-11]。由于炭疽菌属真菌可用于分类的形态指标较少，且其菌落特征、孢子和附着孢的大小、形态仍存在不稳定性，不能很好地区分炭疽菌的种和亚种，表现出极大的局限性。而对基因型分型的分子生物学分类则有力避免了上述问题[12-13]。

1994 年，Sherriff 等[14]将核糖体转录间隔区（Internal transcribed spacer，ITS）序列分析引入了炭疽菌属。截至2020 年7月，NCBI 中已经登录了近23000 条Colletotrichum的ITS 序列，其中芒果上发现的炭疽菌ITS 序列有1200 余条。随着该研究方法应用的深入，前人发现ITS 在种类较多、种间形态学差异较小的炭疽菌属的研究中存在明显局限性。2000 年，Taylor等[15]提出使用基于多基因谱系识别生物物种和系统学种概念。Crouch 等[13]将ITS 与邻近DNA 裂解酶基因Apn2、交配型基因Mat1、氧化物歧化酶基因Sod2位点进行联合分析，对复合群C.graminicola进行了有效区分，并在该属中发现6 个新种。基于多基因分析方法，前人发现前述引起芒果炭疽病的两大病原菌——C.gloeosporioides和C.acutatum，均为复合群，C.gloeosporioides可细分为31 个种1 个亚种[16-23]，而C. acutatum也包含了29 个种[24]。Lima 等[18]联合肌动蛋白基因ACT、钙调蛋白基因CAL、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因GAPDH、β-微管蛋白基因TUB2和ITS 序列对巴西东北部芒果炭疽病病原菌进行分析，发现了C. asianum、C. fructicola、C. tropicale、C. karstii，以及一个新种C.dianesei。2018 年以前，国内报道的芒果炭疽病病原菌主要为C.gloeosporioides，采用的鉴定手段主要是基于传统形态学及ITS 序列。近两年来，通过在传统形态学的基础上引入多基因位点分析的方法，在芒果主产区陆续发现多种芒果炭疽病致病菌。在广西，发现C.asianum、C.siamense、C.fructicola、C.scovillei均能引起芒果炭疽病的发生，且前3 种病原菌为优势种群[25]；在海南，对台农芒果采后炭疽病的病原鉴定，发现其致病菌同广西基本一致，只是未发现致病菌C.scovillei[26]；Li 等[27]对我国海南、云南、四川、贵州、广东、福建等主要产区的芒果炭疽病进行分离，通过形态学观察并联合ACT、几丁质合成酶I 基因CHS-I、GAPDH、TUB2，以及ITS 序列进行分析，在获得的200 余份致病菌中共鉴定出13 种炭疽菌，除上述在我国发现的4 种炭疽菌外，其他9种炭疽菌均是我国芒果炭疽病原的首次报道。目前，国内外已报道的芒果炭疽病的病原菌有28 种，其中国内已报道的有14 种（表1）。

表1 国内外已报道的芒果炭疽菌种类、地理来源及其鉴定所选用的基因Table 1 Species,geographical sources and selected genes of mango anthracnose reported in domestic and abroad

2 芒果采后炭疽病生防菌种类

生防菌是对寄主无害而对病原菌有明显抑制作用的微生物。用于果蔬采后病害的生防菌主要有细菌、酵母菌及丝状真菌。生防细菌是目前商业化生防制剂中应用最广泛的类别，与真核生防菌相比，其来源广泛，繁殖迅速，但易受杀菌剂影响，且在果蔬加工过程中容易失活[45]。生防酵母菌一般通过营养、空间竞争发挥拮抗作用，易于定殖，防效谱广且稳定，近年来已逐渐成为采后病害生物防治的研究热点[46]。由于生防丝状真菌在果蔬上较难定殖，因此丝状真菌往往是通过人工培养后，利用其发酵液进行生物防治[47]。前人通过从不同植物的枝叶及生存的土壤中进行分离筛选，现已获得了部分对芒果采后炭疽病具有一定生防作用的菌株。表2 为目前在芒果采后炭疽病防治中已发现的生防菌及其作用机制。

表2 芒果采后炭疽病生防菌种类及作用机制Table 2 Antagonistic species and mechanisms of mango postharvest anthracnose

2.1 生防细菌

细菌种类繁多，繁殖速度快，在植物和环境中广泛存在，可人工培养，这些特性对细菌占领空间和生存竞争十分有利。因此，有关采后生防细菌的报道很多，而芒果炭疽菌生防细菌主要为芽孢杆菌Bacillusspp.。Balderas-Ruíz 等[54]报道了从墨西哥芒果树上分离得到的贝莱斯芽孢杆菌83 能有效控制芒果炭疽病。汪远等[48]从红树植物秋茄体内分离得到解淀粉芽孢杆菌，该菌株对芒果采后主要病害病原菌C.gloeosporioides具有较强抑制作用，对采后芒果炭疽病防效达到60%以上。谢颖等[55]从海南大羽藓叶片中分离的绿芽孢杆菌对芒果炭疽病最大抑菌率达83%。此外，杨苑等[57]对抗生素溶杆菌进行拮抗试验，抑制率达53.7%。赵超等[58]从芒果叶片与果实中分离筛选出C.gloeosporioides的生防菌，发现荧光假单胞菌对芒果采后炭疽病防效为80.05%，防效明显。Hernandez Montiel 等[60]发现感染海洋细菌嗜根寡养单胞菌KM02的芒果的炭疽病发病率降低了89%，病斑直径减小了92%。

2.2 生防酵母菌

在生防菌中，酵母是控制采后病害的潜力拮抗菌，具有拮抗效果好、抗逆性强、繁殖快速、不产生抗生素、安全性高等优点。许春青[61]发现，季也蒙毕赤酵母与炭疽菌对峙培养时抑菌带明显，该菌产生的挥发性物质对芒果炭疽菌的生长及其分生孢子的萌发有抑制作用，对采后芒果离体叶片的防效达75%。Tian等[62]研究了美极梅奇酵母对台农芒果炭疽病的防治效果，发现在芒果伤口处接种酵母菌和病原菌，于25 ℃贮藏条件下培养12 d，抑制率达78.82%。Konsue等[71]研究发现，Papiliotrema aspenensisDMKU-SP67可以控制胶孢炭疽菌生长，将炭疽病的发病率降低了94.1%，与使用苯菌灵效果相当。此外，膜醭假丝酵母、汉逊德巴利酵母、东方伊萨酵母等酵母菌也被证明对芒果炭疽菌有拮抗作用[59-60,63]。

2.3 生防丝状真菌

除细菌和酵母菌外，用于采后芒果炭疽病生物防治的生防菌还有丝状真菌。丝状真菌来源丰富，能够代谢产生多种具有抗性的物质，利用其发酵液防治芒果病害的研究很多，在芒果炭疽病防治中起重要作用。张诒仙[69]报道了青霉属（Penicillium）的瓦克青霉（T-141 株）、特异青霉（Penicillium notatum）和产黄青霉（Peniciuium chrysogenus）能通过产生青霉素而起到防治芒果炭疽病的作用。黄雪莲等[67]发现，绿色木霉菌挥发性代谢产物及非挥发性代谢产物均有抑菌作用，对芒果炭疽菌的抑菌率达70%以上。De Los Santos-Villalobos 等[66]报道了棘孢木霉T8a 在体内外均能抑制胶孢炭疽菌，且该菌产生的纤维素酶比几丁质酶和葡聚糖酶更具有生物防治作用。

3 生防菌防治机理

由于生防菌、病原菌和寄主三者均为活的有机体，因此三者相互接触后，会发生复杂的的拮抗、诱抗作用。生防菌对病原菌抑制作用可分为两种形式：一是直接作用；二是间接作用。具体防治机理如图1所示。

3.1 直接作用

直接作用是生防菌通过自身或胞外分泌物抑制病原菌，包括营养或空间竞争、分泌拮抗物质、重寄生等。研究表明，生防菌在作用于芒果最初的24 h 内可迅速生长，这个时间段主要的作用方式是营养竞争和空间排斥。而生防菌分泌抑制或杀死芒果炭疽菌的代谢物是最常见的防治方式。拮抗物质主要包括抗生素、拮抗蛋白或细胞壁降解酶类。芽孢杆菌是最普遍的生防菌之一，该菌产生的拮抗物质包括脂肽类抗生素[53]、细菌素[49]、细胞壁降解酶及一些未鉴定的拮抗蛋白[48,73]，可以造成芒果炭疽病菌菌丝扭曲、膨大、畸形，从而抑制芒果炭疽病菌的生长。海洋放线菌发酵产物分离的化合物会破坏芒果炭疽病菌细胞膜的结构。巨大芽孢杆菌的抑菌机制是通过诱导炭疽菌孢子体内活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平及菌丝体内丙二醛（Malonic dialdehyde，MDA）含量，破坏其线粒体和细胞膜而达到抑菌效果[51]。低毒分枝病毒可能会下调与真菌致病力相关的基因表达（如铜胺氧化酶和Fe/S 蛋白）来减弱病原菌的致病性，并抑制其生长。此外，许春青[61]发现，季也蒙毕赤酵母能够吸附到芒果炭疽菌菌丝上，可能存在重寄生作用。

3.2 间接作用

间接作用主要是生防菌通过自身或分泌代谢产物诱导植物产生抵御病原的酶或其他活性物质。美极梅奇酵母、枯草芽孢杆菌除了与胶孢炭疽菌争夺碳源和生存空间、产生抑菌物质，还能促进植物相关防御酶的活性，如β-1，3-葡聚糖酶（β-1,3-gluca-nase，GLU）和几丁质酶（CHT），它们能破坏芒果炭疽菌的细胞壁而达到防治作用[62,74]。任建国等[70]报道了链霉菌与芽孢杆菌能通过诱导芒果植株苯丙氨酸解氨酶（Phenylalllanine ammonialyase，PAL）、多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）和过氧化物酶（Peroxidase，POD）的活性来提高芒果对炭疽菌的抗性。此外，荧光假单胞菌也能通过诱导芒果的抗性来阻止病原真菌的入侵[57]。

随着高效生防菌的不断挖掘及拮抗机理研究的深入，近年来已报道多种实现商业化的菌株。在南非，由枯草芽孢杆菌开发的生防制剂Avogreen 被用于鳄梨炭疽病的防治[75]。美国开发的生防制剂Blight Ban A506，以荧光假单胞菌作为拮抗菌，对苹果、梨和草莓等水果的多种病害具有防治效力[76]。在荷兰与德国，以梅奇酵母为主要成分的生防制剂Shemer 被广泛应用于果蔬灰霉病和青霉病的防治[77]。

4 增强生防菌生防效力的途径

生防菌在芒果采后炭疽病的控制中虽已表现出良好的防效，但活体拮抗菌是生防制剂主要成分，拮抗菌活性及其代谢的酶类易受温度、pH 和湿度等环境因素的影响，导致其防治芒果采后炭疽病的效果不如化学农药稳定。此外，与化学农药相比，生防菌研发成本较高，生效慢，使用期限较短，不如化学农药方便。因此，通过各种方式提高生防菌的生防效力和稳定性，将有助于提高生防制剂的商业化。研究表明，生防菌配合化学药物，生防菌与热处理结合，以及通过基因工程改造措施均能有效提高生防菌防治效力。

生防菌与外源化合物配合使用进一步提高生防效力，是目前芒果采后炭疽病防治的研究热点。这些化合物主要包括低浓度杀菌剂、有机活性物质和无机盐等。Govender 等[50]对咪鲜胺与生防菌联合处理、生防菌单独处理在芒果包装线上防治芒果炭疽病的效果进行评价，发现联合处理生防效力明显高于单独处理。此外，前人发现水杨酸、氯化钙与生防菌配合使用效力提升显著。低浓度水杨酸（SA）对拮抗菌和病原菌的生长影响不大，但对PPO、PAL、GLU 等相关防御酶活性有一定诱导作用，可以通过诱导植物的防御能力，增强生防效力[78]。冯卫华等[79]使用1.0 mmol/L 水杨酸与绿色木霉菌联用，发现该组合对芒果炭疽病的防效明显增强。氯化钙是通过抑制病原菌的生长，并在一定程度上促进生防菌的增殖和芒果的自身防御力来提高生防效力。陈敏等[80]发现，40 g/L CaCl2可有效提升季也蒙毕赤酵母对芒果采后炭疽病的生防效果，其中40 g/L CaCl2与1×108CFU/mL 季也蒙毕赤酵母悬浮液的复合处理比单一处理更能有效抑制芒果果实采后炭疽病的发生。此外，水杨酸溶液、CaCl2溶液和美极梅奇酵母悬浮液的组合也具有协同作用，能提高对芒果果实病害的控制和贮藏效果[81]。

生防菌与热处理结合能提高生防效力，该方法操作简单、成本低，是芒果采后炭疽病防治最常用的方式之一。前人发现，在半商业条件下，咪鲜胺、芽孢杆菌与热水联合处理防治芒果炭疽病比化学制剂的效果更好[50]。Jomduang 等[63]报道了东方伊萨酵母与热处理结合可以增强对芒果炭疽病的防效。此外，对生防菌进行遗传改造是一个新的发展方向。Jones 等[82]将抗菌肽A 的编码基因转入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisia），转化酵母有效地抑制了刺盘孢的孢子萌发，并显著减轻了由该菌引起的番茄炭疽病。然而，目前利用转基因技术防治芒果采后炭疽病的研究较少，对芒果的防治效果有待进一步研究，且改造的菌株应用到实际生产中，必须经过后续的安全验证。

5 总结与展望

近年来，人们已经从多种途径中分离出芒果炭疽病生防菌，且其易培养，繁殖快，防效显著，因此其作为生防制剂的研究价值日益受到关注。目前，生防菌抑菌效果易受环境影响，且控病机制还未完全揭示，因此生防菌的实际生产应用仍存在较大困难。生防菌与外源化合物联用、生防菌配合物理保鲜方式以及生防菌进行遗传改造是其应用到实际生产的重要途径，这不仅可以加强拮抗菌的生防效力和稳定性，还可产生保鲜防腐的栅栏效应。虽然目前我国农业生产仍是化学制剂占主导地位，但随着国际贸易条约的限制以及国家和人民对环境污染和食品安全的愈加重视，以拮抗菌为主的生防制剂必将迎来更快更深入的发展。