西蓝花茎叶氮、硫和硅掺杂的碳量子点对敌敌畏的快速检测方法构建

练志峰，满华盛，修丽丽，黄建颖，董丽娟

（浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江省食品安全重点实验室，浙江 杭州 310018）

碳量子点（carbon quantum dots，CDs）是一类新型荧光材料，具有多种优良性质，如较好的溶解性、荧光性能、低毒性和优异的生物相容性，在不同领域得到广泛应用。近年来，对于CDs的应用，已经有报道在荧光传感器、生物细胞和纳米医学等方面。不同的CDs因其制备的原料不同，在表面会形成不同的官能团，如氨基、羟基、巯基和羧基等，从而赋予其不同的特性。

西蓝花（L. var.Planch.），作为常见的食材因其营养丰富、全面，被称之为蔬菜皇冠，且被广泛食用，而西蓝花的茎叶作为农业废弃物会造成环境污染和经济损失。但是西蓝花茎叶储量十分巨大，且并不是无法利用。对于西兰花制备CDs的研究，国内鲜见报道，而国外的Arumugam等以西兰花为原料，采用一步水热法合成了CDs，使其具有光致发光特性，以及对银离子较强的荧光猝灭选择性。另一方面，有机磷农药（organophosphorus pesticide，OPs）目前逐渐替代有机氯农药被广泛使用。但是，过度使用的同时也造成了环境污染，最终威胁到人们健康和安全。目前普遍使用的检测方法如色谱法、光谱法需要大型仪器且费时。而酶抑制法具有低检出限以及方便的特点，如Kumar等研制了一种固定化银纳米粒子（AgNPs）的酶介导生物传感器，用于检测有机磷OPs。该方法是基于马拉硫磷或敌百虫对酶的抑制作用，在固定化过程中阻止硫胆碱的生成从而使AgNPs的量上升。在添加OPs的过程中测定了酶活性的效率，且AgNPs的增加依赖于OPs的浓度，且能够通过紫外-可见光谱法在420 nm处分别对马拉硫磷和敌百虫进行检测，检出限低至0.455 nmol/L和5.46 nmol/L。此外，该检测方法也成功地应用于实际样品中OPs的检测。

因此，为了保障食品和人们的公共健康安全，对OPs进行可靠、灵敏的定量分析十分重要。本实验在制备了基于西蓝花废弃物的碳点后，进一步构建了氧化还原型CDs/Fe酶抑制体系，用于检测OPs的含量，并应用于实际生活中的农产品OPs残留检测，为将来绿色、快速、实时高效的荧光探针应用提供理论依据。在实现对农药检测的同时也很好地利用西蓝花茎叶这一废弃的资源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

西蓝花茎叶、苹果、芹菜 市购；浓硫酸、硫酸亚铁、30%双氧水、硫酸奎宁、正丁醇、三(羟甲基)氨基甲烷（Tris）（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；98%的乙酰胆碱、乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶 美国Sigma-Aldrich公司；敌敌畏 上海泰坦科技有限公司。

1.2 仪器与设备

榨汁机 中国九阳股份有限公司；2-16KL高速冷冻离心机 德国西格玛公司；－80 ℃超低温冰箱 上海汗诺仪器有限公司；QXR1200-50马弗炉 合肥科晶材料技术有限公司；PHS-3C型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；Smart系列纯水/超纯水仪 默克密理博实验室设备（上海）有限公司；EL 204-IC电子天平梅特勒-托利多仪器有限公司；Zetasizer Nano ZS激光粒度仪 英国马尔文仪器有限公司；Labconco FreeZone立式冷冻干燥机 美国Labconco公司；UV-2600紫外-可见分光光度计、RF-5301 PC荧光分光光度计、AXIS Supra X射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）仪 日本Shimadzu公司；Empyrean型X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）仪 荷兰帕纳科公司；RCT型加热磁力搅拌器 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 西蓝花CDs的制备

准确称取10.0 g西蓝花叶和茎，将其加入100 mL纯水中。经果汁机榨汁后，全部转移放入聚四氟乙烯内衬的高压不锈钢反应釜中，在200 ℃条件下持续水热反应8 h。冷却后，离心，取黄色上清液。经0.22 μm的滤膜过滤得到粗产品。此粗产品利用透析袋（截留分子质量100～500 Da）透析，冷冻干燥后得到棕色的CDs 0.8 g。

1.3.2 CDs的表征

1.3.2.1 粒度测定

采用Zetasizer Nano ZS激光粒度仪对CDs溶于水后的粒径进行测定。

1.3.2.2 XRD测定

采用Empyrean XRD仪对西蓝花茎叶粉以及CDs粉进行XRD表征。

1.3.2.3 XPS测定

采用AXIS Supra XPS仪对CDs进行XPS表征。

1.3.2.4 紫外吸收光谱

使用紫外-可见分光光度计测定CDs溶液的紫外吸收光谱，扫描波长范围为200～800 nm，每个样品做3 次平行测定。

1.3.2.5 荧光发射光谱

使用荧光分光光度计测定多个浓度的CDs溶液的荧光发射光谱，得出最佳的荧光浓度后，确定激发波长范围为290～380 nm，扫描波长范围为220～900 nm，狭缝宽度为3.0 nm，每个样品做3 次平行测定。

1.3.2.6 荧光量子产率

选择量子产率为0.54的硫酸奎宁作为标准物质分散于0.1 mol/mL的硫酸溶液中，进行CDs荧光量子产率的测定。分别测出CDs溶液和硫酸奎宁相对应的吸光度并选择相同的激发波长（360 nm）以此计算相应的发射峰面积，根据下式计算量子产率：

式中：为荧光量子产率；为荧光积分面积；为溶剂折射率，水的折射率为1.33，0.1 mol/L硫酸的折射率为1.33；为对应的吸光度；下标s表示硫酸奎宁，CDs表示CDs溶液。

1.3.3 酶抑制法荧光检测OPs

将制备得到的CDs与Fe混合得到能对HO有良好线性关系的荧光探针，其中CDs质量浓度为0.25 mg/mL，Fe浓度为5 mmol/mL。利用荧光探针进行OPs的检测与标准曲线的绘制，将1.0 mL乙酰胆碱酯酶（0.5 U/mL，Tris-HCl，pH 7.0）分别添加到2.5 mL不同质量浓度（1.0、0.75、0.50、0.30、0.10、0.075、0.05、0.03、0.01、0 μg/mL）的敌敌畏溶液中。将所有混合物在37 ℃轻轻搅拌10 min，然后添加0.5 mL乙酰胆碱（0.01 mmol/mL）和1.0 mL 0.25 U/mL胆碱氧化酶。在37 ℃的避光条件中进一步搅拌20 min后，将5.0 mL含有CDs（2.5 mL，1 mg/mL）和Fe（2.5 mL，20 mmol/L）的混合溶液添加到每个反应物上。然后将溶液完全混合，然后在室温下用荧光分光光度计记录360 nm激发光下的荧光发射光谱，再设置两组对照组作为比较，以敌敌畏质量浓度的对数值为横坐标，荧光相对强度为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.4 酶抑制法对实际食品样品中OPs的荧光分析

参考Lin Bixia等方法，选取新鲜苹果与芹菜为样品，称取样品的表皮或茎叶2.0 g，置于离心管中并加入10 mL纯水，然后4 ℃、5 000 r/min离心30 min，取上清液用0.22 μm孔（微孔）聚醚砜滤膜过滤待测。然后在试管中加入的乙酰胆碱酯酶（0.5 U/mL）1.0 mL，酶均用Tris-HCl（pH 7）缓冲溶液溶解，再加入待测液2.5 mL，将此混合溶液置于37 ℃水浴中，搅拌反应10 min后，分别依次加入0.01 mmol/mL的氯化乙酰胆碱0.5 mL以及胆碱氧化酶（0.25 U/mL）1.0 mL，于37 ℃条件下水浴，避光搅拌反应20 min。随后分别加入探针溶液5.0 mL（2.5 mL的1 mg/mL CDs和2.5 mL的20 mmol/L Fe溶液），混合均匀，控制10 mL的混合溶液中CDs质量浓度为0.25 mg/mL，Fe浓度为5 mmol/L。利用荧光分光光度计，对混合溶液进行荧光检测，设置激发波长为360 nm，根据荧光强度以及对照标准曲线推算OPs的存在量。

1.4 数据统计与分析

每组实验重复3 次平行实验，数据分析软件选择Excel 2010，绘图选择Origin 8.0软件。

2 结果与分析

2.1 CDs的粒径和量子产率

将得到的CDs进行透析处理之后，测得CDs的平均粒径为30 nm左右。荧光量子产率是光化学反应中光量子利用率，影响反应物利用情况与荧光发光效果。根据1.3.2.6节公式计算可以得出所制备CDs的量子产率约为9.53%。

2.2 XRD分析

通过对材料进行X射线处理，在经分析其衍射图谱后，可以获得材料对应的成分与分子的结构和形态等相关信息。CDs和冻干粉的XRD图谱如图1所示，在2＝28°处出现一个尖峰，其产生源于典型的石墨结构，同时对应层间距为0.34 nm，表明西蓝花茎叶水热处理后形成了有序的sp碳层（C＝C）。参考相关文献，2＝32°处的尖峰可归因于石墨层，这能够进一步表明CDs具有较高程度的石墨化。在36°较和42°较处的峰值与半结晶或无定形碳纳米颗粒有关，这与相关的报道有所不同，同时，与西蓝花在2＝23°处出现的非晶态宽峰不同，CDs在2＝25°宽处观察到一个产生了位移的非晶态宽峰，更证明了其结构的改变。

图1 西蓝花冻干粉和CDs的XRD图Fig. 1 XRD patterns of lyophilized broccoli powder and CDs

2.3 XPS分析

图2 CDs的XPS测量光谱（A）以及高分辨谱C1s（B）、N1s（C）和O1s（D）Fig. 2 XPS spectra of CDs (A) and high resolution spectra C1s (B),N1s (C) and O1s (D)

XPS研究CDs的表面元素组成以及其化学状态，进一步确定了CDs的组成和价态。制备得到的CDs中O1s、N1s、C1s、Si2s和Si2p的结合能分别为531.7、399.7、284.7、165.5、151.0 eV和101.0 eV。同时可以观察到CDs在165.5 eV处，有相对较为微弱S2p光谱（图2A），根据文献可推测硫原子已掺杂到了碳原子中。如CDs的高分辨率XPS光谱（图2B～D）所示。制备的CDs的C1s光谱中，在284.6、285.9、287.7 eV和288.5 eV处观察到4 个峰值，结合能分别对应C—C/C＝C、C—N/C＝O、C—S和O—C＝O。在531.6 eV和532.8 eV处的O1s峰，分别为C＝O和C—OH/C—O—C的特征氧态。在151 eV和101 eV处的峰值推测归因于Si元素，从而证明了CDs和西蓝花中存在Si元素。另外，中心位于399.6 eV和400.1 eV的两个不同的N1s峰，根据文献[19]推测对应于类吡咯氮和类石墨氨基氮。这些实验数据进一步表明，由西蓝花茎叶制备的CDs具有石墨性质的碳核和丰富的官能团。

2.4 紫外吸收光谱分析

制备的CDs溶液（0.25 mg/mL）紫外-可见光吸收光谱如图3所示。CDs溶液在275 nm处出现了一个较宽的吸附峰，其产生的原因为石墨结构的存在以及电子的π→π*和n→π*跃迁。同时测定了CDs溶液在普通日光灯和紫外光（360 nm）处的显色情况发现分别为浅黄色且透明（插图a），和明亮的蓝色（插图b），表明CDs表面存在良好的荧光性能的位点。

图3 0.1 mg/mL CDs溶液的紫外吸收光谱Fig. 3 UV-vis absorption spectrum of 0.1 mg/mL CDs in aqueous solution

2.5 荧光发射图谱分析

不同质量浓度CDs溶液在360 nm激发波长下的荧光发射光谱有所不同。过大或过小的CDs质量浓度均会导致荧光发射强度的降低，推测是由于CDs本身的荧光性质所引起的。同时也确定了CDs有相对较好荧光效果时的质量浓度为0.25 mg/mL。

CDs溶液（0.25 mg/mL）在不同激发波长下的荧光发射光谱和光学图像如图4所示。由图4A可看出，当激发波长在300～360 nm时，样品溶液的荧光最大发射强度有明显的增强，在激发波长为360 nm时，440 nm发射波长处的荧光达到最大。由于CDs具有较为均匀的尺寸，发射波长的红移相对较小。当激发波长从360 nm增加到380 nm时，发射波长出现红移并且伴随着荧光发射强度的减弱，证明了制备所得的CDs具有明显的波长可调能力。同时样品溶液在不同激发波长下的发射光谱表明其拥有多色发射的特性，这种激发依赖现象推测是因为CDs在水热碳化反应中，表面形成了羧基和氨基等官能团从而充当了激发能阱而引发不同的光致发光特性。另外，如图4B所示，不同激发波长下的光学图像证明了CDs的多色发光特性，同时发现CDs的颜色范围较之前的报道宽，发射颜色从蓝色、绿色、黄色到红色，最后再回归蓝色，由此推测其能够用于多色成像，荧光油墨等。

图4 在不同激发波长下CDs的荧光发射图谱（A）以及光学图（B）Fig. 4 Fluorescence emission spectra (A) and optical spectra (B) of CDs at different excitation wavelengths

2.6 酶抑制法荧光检测OPs

Fe对CDs的荧光有猝灭作用，OPs对乙酰胆碱酯酶活性有抑制作用，从而减少胆碱被酶解产生的HO量。当以敌敌畏为代表的OPs存在的情况下，酶活性被抑制，HO产生量会减少，溶液中Fe浓度相较于不加OPs的溶液低，CDs荧光就会增强，根据不同质量浓度梯度的敌敌畏绘制标准曲线，从而进一步应用于实际农产品的敌敌畏残留检测。

图5显示了CDs/Fe荧光探针，对酶液添加不同质量浓度敌敌畏的荧光响应情况。如图5A、B所示，在敌敌畏质量浓度为0 μg/mL时，混合反应液产生的HO将Fe氧化成Fe，导致CDs荧光被猝灭，而在敌敌畏存在的情况下，敌敌畏通过不可逆地抑制乙酰胆碱酯酶的催化活性，影响胆碱的形成，并进一步抑制过氧化氢的生成，使体系荧光降低程度逐渐减小甚至不降低。另外可以发现，即使敌敌畏质量浓度为0.01 μg/mL，荧光也发生了轻微改变，证明荧光探针对体系中存在的敌敌畏十分敏感。当敌敌畏质量浓度高达1 mg/mL时，荧光对比无HO体系也有轻微的下降，证明体系中存在微量HO，表明此敌敌畏质量浓度下的酶并非完全失活。根据实验结果，当体系中Fe最终浓度为5 mmol/mL，CDs最终质量浓度为0.25 mg/mL时，敌敌畏质量浓度对数的荧光强度比与CDs质量浓度对数呈良好的线性关系（＝0.991 7），回归方程为/＝1.317 3＋0.149 4lg，其中，和分别为CDs/Fe体系中敌敌畏不存在和存在下的荧光强度。由此可见，体系的荧光强度具有质量浓度依赖性，根据公式3/（其中为标准偏差，为线性回归方程的斜率），预估敌敌畏的检出限为8 ng/mL。根据公式10/，预估敌敌畏的定量限为26.7 ng/mL。所以CDs/Fe荧光探针能够很好地用于检测敌敌畏的质量浓度，可以为生活中的食品样品的OPs检测提供一种快速、绿色、简便的新方法。

图5 不同质量浓度敌敌畏对检测系统中C点荧光的影响（A、B）及C点荧光强度比与敌敌畏质量浓度对数的线性关系（C）Fig. 5 Effect of dichlorvos at different concentrations on the fluorescence of C-dots in detection system (A, B) and linear relationship between the fluorescence intensity ratio of C-dots and the logarithm of dichlorvos concentration (C)

2.7 酶抑制法检测实际食品样品中的OPs

根据以上的优化与探究实验，建立了CDs/Fe荧光探针检测敌敌畏的酶抑制法检测体系，并将其应用于苹果和芹菜中敌敌畏的测定。通过标准加入回收法对这两种易残留农药的样品，进行测试以评估该方法的准确性。每种样品设置3 个不同的加标量，每个加标样品平行测试3 次，结果如表1所示。两种食品样品中均未检测出敌敌畏农药的存在，说明超市中销售的商品较为安全。两种加标食品样品中敌敌畏回收率在90%～97%之间，相对标准偏差不高于1.0%（=3），表明该方法对实际样品中以敌敌畏为代表的OPs的检测，具有良好的准确度和精密度，可以考虑未来将该CDs/Fe荧光传感器应用于生物和食品领域中OPs的检测。

表1 商业水果蔬菜中敌敌畏的检测以及回收率Table 1 Recoveries of dichlorvos in spiked commercial fruits and vegetables

3 讨 论

以西蓝花茎叶作为前体，经过水热处理后制得了量子产率约为9.53%的新型氮、硫、硅掺杂CDs，并具备良好的水溶性和光致发光性。实验采用动态光散射仪，测得其粒径约为30 nm。后续利用采用XRD、XPS等对其进行相应的结构表征以及相关元素分析，证明制备的CDs为新型氮、硫、硅掺杂CDs并产生了一定的石墨烯特征，且表面存在许多功能性的官能团，这些官能团中包含了氧、氮、硫和硅等元素，使得CDs同时具备良好的水溶解性和荧光性能。

本研究结果表明，Fe可以猝灭新型氮掺杂CDs的荧光，而同等浓度Fe对其影响不大，由此推断，HO将Fe氧化为Fe，Fe与CDs产生配位，同时它可以转移到Fe的空d轨道，从而导致混合溶液的荧光猝灭，这是一个静态猝灭过程，与前人的报道一致。然后依据酶抑制反应原理，构建了酶抑制反应体系，优化Fe在实验中的浓度，将所制备的荧光传感器利用酶抑制法荧光检测了敌敌畏，研究了CDs/Fe的荧光强度在混合酶液之后与敌敌畏质量浓度间的定量关系，结果表明敌敌畏质量浓度对数与CDs的荧光强度呈良好的线性关系（=0.991 7），回归方程为/=1.317 3＋0.149 4lg，且敌敌畏的检出限约为8 ng/mL，对比同类文献检出限更低，方法更快捷简便，更有优势。由此得出CDs/Fe/乙酰胆碱酯酶荧光探针能够很好地用于检测OPs的浓度，后续可以为实际食品样品的OPs残留检测提供一种快速、绿色、简便的新方法。然而，当前Ops农药品种较多，对于其他OPs检测仍需要进一步的研究。其次需要提高反应前体利用率，开发荧光量子产率较高的CDs，也需要进一步增加CDs在检测方面的稳定性与灵敏度。

4 结 论

以原料丰富的西蓝花茎叶作为反应前体，通过温和的水热处理制备得一种新型氮、硫、硅掺杂CDs，并利用Fe和HO之间的氧化反应构建了可用于分析HO的荧光传感器，以及可定量检测低浓度下的HO，具有易于操作、安全环保、线性范围宽、检出限低、灵敏度高和响应速度快等优点，在食品和生物系统中具有巨大的应用潜力，并进一步利用该关系构建了可分析OPs的荧光探针，并已成功将其应用于食品样本中以敌敌畏为代表的OPs的检测，结果也比较理想，为其后续应用于实际的生产提供了一定理论基础。