柠檬醛-壳聚糖涂膜协同流化冰贮藏对养殖大黄鱼品质影响及主成分分析

周勇军，周强

（闽南科技学院生命科学与化学学院，福建 泉州 362332）

大黄鱼（Larimichthy scrocea）鲈形目、石首鱼科、黄鱼属，是中国传统海水经济养殖鱼类［1］。低温冷藏是水产品主要的贮藏保鲜方式之一，但低温下，大黄鱼极易受腐败微生物、内源酶及脂质氧化等作用影响而引起腐败变质［2］。目前，国内外学者对防止大黄鱼腐败变质及脂肪氧化等品质劣化问题做了大量研究工作。赵思敏等［3］研究表明流化冰对大黄鱼预冷和保鲜效果比传统碎冰具有明显优势。而郭儒岳等［4］指出流化冰可有效缩短冷却时间并延长大黄鱼货架期。学者也尝试应用各类生物保鲜剂辅助低温对各类水产品进行保鲜处理，如乳酸链球菌素［5］、茶多酚［6］、龙须菜寡糖［7］、海藻酸钠［8］。柠檬醛是从山苍子（Litsea cubeba（Lour.）Pers.）、柠檬草（Cymbo⁃pogon citratus（DC.））、垂叶香矛（Mosla chinensis Maxim）等芳香植物中提取出的具有挥发性、浓郁香味的脂溶性天然混合物［9］，孟玉霞等［10］研究指出柠檬醛可有效抑制大黄鱼腐败菌并维持其感官品质。壳聚糖属生物保鲜剂，具有良好的成膜特性和抑菌性能［11-12］。主成分分析为一种降维分析法，通过保留重要信息并对降维后的特征向量进行线性变换，将原来的多个指标组合成几个综合指标，旨在用较少的综合指标来反映原始指标信息［13］。国内外报道集中探讨了植物精油对各类腐败微生物的抑制作用，而对于柠檬醛-壳聚糖复合保鲜液协同流化冰应用于大黄鱼贮藏保鲜还鲜有报道。本研究引入柠檬醛作为抑菌剂及抗氧化剂，以壳聚糖作为抑菌基底液，制备柠檬醛-壳聚糖复合保鲜液，流化冰（-3℃）贮藏大黄鱼，探究柠檬醛-壳聚糖（生物复合保鲜）与流化冰（物理保鲜）协同作用对大黄鱼贮藏品质的影响，为大黄鱼低温储运提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜大黄鱼，购自宁德海蒙正宗霞浦野生海鲜批发市场，挑选个体适中，质量为（200±20）g无损伤的大黄鱼，体表光滑且有光泽，鲜活运输至实验室。

1.2 主要仪器

DHP-9227型电热恒温培养箱：上海捷呈实验仪器有限公司；BSP-150实验室培养箱：北京海天友诚科技有限公司；PB-10台式数显酸度计：上海诺萱科学仪器有限公司；LC-760液相色谱仪：武汉美睿仪器有限公司；RF-1000-SP流化冰生成机：江苏南通瑞友工贸有限公司；UV3802S紫外可见分光光度计：华威科创（武汉）科技有限公司等。

1.3 试剂

壳聚糖（脱乙酰度85%，分子量20万U），中山市华中食品添加剂有限公司；柠檬醛，江西吉安中香天然植物精油有限公司；丙二醛（MDA）检测试剂盒，购自南京建成生物。

牛肉膏、蛋白胨、琼脂等为生化试剂，硼酸、甲基红、乙醇、氯化钠、碳酸钾、氢氧化钠、邻苯二酚、磷酸二氢钠等为分析纯，均购自国药集团。

1.4 原材料的处理

流化冰制备：首先配制3.0 mg/L NaCl盐度计校准液，后采用流化冰生成机制备流化冰固液混合相（体积分数80%颗粒状冰块与体积分数20%水），备用［14］。

稀冰醋酸浸渍液制备：量取10 mL2.0%冰醋酸置于1 000 mL容量瓶，并采用蒸馏水定容，后置于4℃冰箱冷藏备用。

壳聚糖保鲜涂膜液制备：称量20.0 g壳聚糖，加入10 mL 2.0%冰醋酸，用蒸馏水定容至1 000 mL，置于4℃的冰箱里备用。

柠檬醛-壳聚糖复合保鲜液制备：称量20.0 g壳聚糖，加入10 mL 2.0%冰醋酸溶解，添加0.25 mL柠檬醛摇匀，用蒸馏水定容至1 000 mL，制备0.025%柠檬醛（v/v）-2%壳聚糖（w/v）复合保鲜液，置于4℃的冰箱里备用。

挑选完整、大小均一的新鲜大黄鱼冰水猝死，去内脏后采用无菌超纯水清洗至无血水，置于无菌纱布上沥干，整鱼大小约25.0 cm×6.0 cm×2.5 cm，备用，随机分为3组。对照组：采用稀冰醋酸浸渍10 min，于流化冰（-3±0.5）℃贮藏（流化冰∶鱼=3∶1（V/V））；处理组A：壳聚糖浸渍涂膜10 min，于流化冰（-3±0.5）℃贮藏（本试验采用-3℃能较好的保持流化冰两相稳定性）；处理组B：0.025%柠檬醛-壳聚糖涂膜10 min，捞出后稍晾干，添加流化冰保鲜处理（-3±0.5）℃贮藏。

所有处理的流化冰每12 h更换一次，每组设3个平行样，每隔3 d测量指标数据，试验重复3次。

1.5 指标测定

pH值测定：pH值变化可反映肉类产品腐败变质程度，参照张宁宁等［15］的方法测定；挥发性盐基氮测定（TVB-N）：TVB-N指动物性食品由于酶和细菌分解蛋白质产生氨及胺类等碱性含氮物质，为原料鱼和肉类的主要鲜度指标，参照刘文丽等［16］的方法，采用扩散皿法进行TVB-N测定；菌落总数测定：菌落总数测定可用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，参照《GB 4789.2-2016食品微生物学检验菌落总数测定》测定；K值测定：K值是鱼类早期鲜度的重要指标，为次黄嘌呤和次黄嘌呤核苷之和与腺苷三磷酸及其分解物总量比值的百分率，参照Yoloyama等［17］的方法测定；盐溶性蛋白溶出比测定：盐溶性蛋白溶出比反映了蛋白质的变性程度，参照迟海等［18］的方法测定；酸价测定：酸价是反映脂肪水解的重要指标，参照谢晶等［19］的方法进行测定；TBARS测定：TBARS值是衡量脂肪氧化的主要指标，参照Yarnpakdee等［20］的方法进行测定；MDA含量测定：MDA是常用的膜脂过氧化指标，参照汪金林等［21］的方法采用检测试剂盒测定其MDA值。

1.6 数据处理

试验中所有试样进行3个平行测定，试验重复3次，测定结果表示为xˉ±s，数据采用SPSS 20.0软件处理分析。指标均值差异显著性分析采用多重比较（邓肯法）进行。主成分分析采用因子分析法进行指标的降维。

2 结果与分析

2.1 大黄鱼贮藏期间品质指标变化

2.1.1 大黄鱼贮藏期间pH值变化 如图1所示，随着贮藏时间延长，pH值表现为先下降后上升的趋势，且对照组与处理组A各贮藏时间水平对应pH值差异显著（P<0.05）。同一贮藏期（第6天开始），对照组pH值显著高于处理组A、处理组B，且差异显著（P<0.05），贮藏后期（第9~12天），处理组B大黄鱼pH值显著低于处理组A（P<0.05）。贮藏过程中对照组pH值上升较快，贮藏第12天，对照组、处理组A、处理组B的pH值分别为7.83、7.28、7.05。

图1 不同处理方式对大黄鱼贮藏期间p H值影响Figure 1 Effects of different treatments on pH value in Larimichthyscrocea during storage

2.1.2 大黄鱼贮藏期间TVB-N值变化 如图2所示，各试验组TVB-N值与贮藏时间呈正相关，且不同贮藏时间各水平间对应TVB-N值差异显著（P<0.05）。同一贮藏时间（第3~12天），处理组A、处理组B的TVB-N值较对照组低，且差异显著（P<0.05）。贮藏第12天，处理组B、处理组A、对照组的TVB-N值分别为12.36、17.47、27.24 mg/100g，处理组A、处理组B的TVB-N为对照组的64.13%、45.37%，由此可知，处理组可有效抑制大黄鱼TVBN值的上升。

图2 不同处理方式对大黄鱼贮藏期间TVB-N值影响Figure 2 Effects of different treatments on volatile basic nitrogen in Larimichthyscrocea during storage

2.1.3 大黄鱼贮藏期间菌落总数变化 由图3可知，样品菌落总数与贮藏时间呈正相关，贮藏期内各水平间对应的菌落总数具有显著差异（P<0.05）。贮藏期内（第3~12天），处理组A与处理组B的菌落总数低于对照组，且差异显著（P<0.05）。对照组菌落总数在第9天为5.53 lg（CFU/g），接近二级鲜度上限。贮藏末期（第12天），对照组、处理组A、处理组B菌落总数分别为6.74、4.25、3.64 lg（CFU/g），处理组A、处理组B菌落总数较对照组下降了36.94%、45.99%。说明，处理组在贮藏末期可减缓大黄鱼菌落总数的上升，延长其货架期。

图3 不同处理方式对大黄鱼贮藏期间菌落总数影响Figure 3 Effects of different treatments on total numbers of colony in Larimichthyscrocea during storage

2.1.4 大黄鱼贮藏期间K值变化 如图4所示，随着贮藏时间延长（第3~12天），贮藏时间各处理对应的K值差异显著（P<0.05）。相关性分析可知，大黄鱼K值与贮藏时间呈高度正相关，其相关系数分别为0.940、0.957、0.929，且均 有 统计学意 义（P<0.05）。同一贮藏期（第3天开始），处理组A、B对应的K值显著低于对照组（P<0.05）。对照组的K值在贮藏中后期上升幅度较大，处理组B的K值在贮藏后期（第9、12天）显著低于处理组A（P<0.05）。贮藏第9天，对照组、处理组A、处理组B均为一级鲜度。

图4不同处理方式对大黄鱼贮藏期间K值影响Figure 4 Effects of different treatments on K value in Larimichthys crocea during storage

2.1.5 大黄鱼贮藏期间盐溶性蛋白溶出比变化如图5所示，与处理组比较，对照组贮藏第6、9、12天大黄鱼盐溶性蛋白溶出比显著降低（P<0.05），且处理组B显著高于处理组A（P<0.05）。贮藏第12天，处理组B、处理组A、对照组盐溶性蛋白溶出比分别为74.92%、65.48%、51.00%，处理组A、处理组B盐溶性蛋白溶出比为对照组的1.28、1.46倍。说明，处理组B对应的盐溶性蛋白溶出比维持在较高水平，大黄鱼肌原纤维蛋白的稳定性较好。

图5 不同处理方式对大黄鱼贮藏期间盐溶性蛋白溶出比影响Figure 5 Effects of different treatments on dissolution ratio of salt-soluble protein in Larimichthyscrocea during storage

2.1.6 大黄鱼贮藏期间酸价变化 如图6所示，试验组的酸价随着贮藏时间的延长呈上升趋势。不同贮藏时间（第9、12天），酸价大小顺序依次为处理组B<处理组A<对照组，且各水平间酸价差异显著（P<0.05）。贮藏第12天，对照组、处理组A、处理组B酸价分别为8.06、6.35、5.75 g/100g，处理组A、处理组B与对照组比较，下降了21.22%、28.56%。由此可知，在贮藏末期，处理组（柠檬醛、柠檬醛-壳聚糖）协同流化冰处理可减缓大黄鱼脂肪的水解酸败。

2.1.7 大黄鱼贮藏期间TBARS值变化 如图7所示，随着贮藏时间的延长，大黄鱼对照组及处理组TBARS值均呈上升趋势，且不同贮藏期内各水平间对应TBARS值差异显著（P<0.05）。由相关性分析可知，大黄鱼TBARS值与贮藏时间呈正相关，其相关系数r分别为0.989、0.980、0.983，且均有统计学意义（P<0.05）。贮藏前期（第3天）TBARS值增长较缓慢，从第6天开始呈快速增长趋势，贮藏第12天，对照组、处理组A、处理组B的TBARS值分别为6.57、3.42、2.74 mg/kg。由此可知，贮藏期内，处理组可显著抑制大黄鱼的脂肪氧化。

图6不同处理方式对大黄鱼贮藏期间酸价影响Figure 6 Effects of different treatments on acid value in Larimichthyscrocea during storage

图7 不同处理方式对大黄鱼贮藏期间硫代巴比妥酸反应物的影响Figure 7 Effects of different treatments on TBARS value in Larimichthyscrocea during storage

2.1.8 大黄鱼贮藏期间丙二醛（MDA）含量变化由图8可知，大黄鱼MDA随着贮藏时间延长呈上升趋势，不同贮藏期各水平间对应的MDA存在显著差异（P<0.05）。贮藏期内（第3~12天），大黄鱼MDA值大小顺序依次为对照组<处理组A<处理组B，且各试验组间差异显著（P<0.05）。处理组B、处理组A、对照组在第12天对应的丙二醛含量分别为0.624、0.645、0.844 mg/kg，处理组A、处理组B为对照组的76.42%、77.25%。

图8 不同处理方式对大黄鱼贮藏期间丙二醛含量的影响Figure 8 Effects of different treatments on MDA value in Larimichthyscrocea during storage

2.2 大黄鱼贮藏期间各品质指标主成分分析

由表1可知，特征值（7.315）大于1的有1个主成分，总方差贡献率91.440%。柠檬醛-壳聚糖涂膜协同流化冰贮藏对养殖大黄鱼品质指标由初始8个降为1个主成分，达到降维目的。由表2可知，pH、挥发性盐基氮、菌落总数、K值、盐溶性蛋白溶出比、酸价、TBARS值、MDA值在第1主成分上有较高载荷，说明第1主成分可以主要反映这8个指标信息，其中，pH、挥发性盐基氮、菌落总数、K值、酸价、TBARS值、MDA在正坐标处具有较高载荷，而盐溶性蛋白溶出比在负坐标处有较高载荷。在主成分矩阵中，检测绝对值反映对主成分贡献率大小。比较第1主成分中贡献率大小为盐溶性蛋白溶出比>菌落总数=TBARS>挥发性盐基氮>K值>pH>酸价>MDA。通过得分系数可将各个变量进行线性组合，建立关于Y1（第1主成分）与X1（pH）、X2（挥发性盐基氮）、X3（菌落总数）、X4（K值）、X5（盐溶性蛋白溶出比）、X6（酸价）、X7（TBARS值）、X8（MDA含量）的得分系数模型，由此第1主成分提取为：Y1=0.131X1+0.133X2+0.133X3+0.132X4-0.134X5+0.130X6+0.133X7+0.118X8。

表1 主成分方差分析Table 1 Analysis of variance for PCA

表2 成分载荷矩阵Table 2 Loading matrix for PCA

3 讨论

鱼体宰杀后其pH值通常表现为先下降后上升的趋势［22-23］。这主要是贮藏前期糖原和ATP分解产生乳酸和磷酸，pH值呈现下降趋势，而贮藏中后期鱼体自身内源酶及微生物产生的外源酶分解蛋白质产生碱性胺类物质导致pH值出现上升。本研究中，处理组B、处理组A均可一定程度上抑制大黄鱼贮藏期间pH值上升，且在贮藏后期，处理组B的抑制效果较显著。可推测这与柠檬醛抑菌性有关，大黄鱼经复合保鲜液涂膜处理后，表面腐败菌生长受到抑制，产生胺类等碱性物质相应降低，而壳聚糖涂膜可减少柠檬醛在鱼体表面的流失，进一步强化了该效应。雷丽萍等［24］尝试采用茶多酚对大黄鱼进行冰藏保鲜，大黄鱼贮藏期间pH值显著低于空白对照组，其大黄鱼样品（3.0 cm×3.0 cm×1.0 cm鱼片）贮藏12 d的pH值为6.85，稍低于本试验处理组B贮藏12 d的pH值（7.05），这也与大黄鱼样品（（200±20）g整鱼）及分割处理有关。挥发性盐基氮（TVB-N）与水产品鲜度有较好相关性，常用于评价鱼类等水产品的腐败程度［25］。一般认为，海水鱼对应TVB-N值≤20 mg/100g为一级鲜度，TVB-N值在20~30 mg/100g为二级鲜度。对比标准，贮藏第6天，对照组大黄鱼挥发性盐基氮接近一级鲜度上限，贮藏末期（第12天），大黄鱼处理组A与处理组B均处于一级鲜度，而对照组接近二级鲜度上限，就考察一级鲜度而言，处理组B可延长货架期约6 d。卢亭等［26］采用5种保鲜技术应用于大黄鱼（1 000±100）g的贮藏保鲜，研究发现，复配保鲜剂组（壳聚糖、磷酸盐、海藻酸钠）可有效抑制其TVB-N上升，推荐货架期为6~9 d，这与本研究结果较一致，但大黄鱼样品的尺寸大小也是影响货架期的重要因素，有待后续进一步研究比较。菌落总数常作为衡量鱼肉腐败程度的重要指标［4］。本研究中，贮藏末期（第12天），对照组超出6.0 lg（CFU/g）二级鲜度标准，而处理组A、处理组B为一级鲜度水平，就菌落总数指标而言，处理组B较对照组延长货架期约6 d。这主要与柠檬醛-壳聚糖抑菌性有关，另外，流化冰低温效应可进一步延缓腐败菌对蛋白质的分解作用，从而抑制TVB-N值与菌落总数的上升。K值能反映水产品在贮藏过程中新鲜度的变化情况［17］。水产品的K值范围对应不同的鲜度水平，一级鲜度为20%以下，二级新鲜度为20%~40%，初级腐败为60%~80%。贮藏第9天，对照组、处理组A、处理组B均为一级鲜度，贮藏第12天，对照组处于二级鲜度，处理组仍维持一级鲜度。本试验中，处理组A、处理组B在贮藏中后期可显著抑制大黄鱼K值的上升，且柠檬醛-壳聚糖协同流化冰处理效果较优（P<0.05）。柠檬醛-壳聚糖复合保鲜液具有较好的抑菌效果，可有效降低微生物及酶对鱼体的分解作用，本研究中采用的流化冰降温速度快，可有效降低微生物细胞膜流动性及生理代谢作用，减缓大黄鱼贮藏期K值上升。盐溶性蛋白溶出比决定了蛋白质的功能特性［18］。本研究中，处理组A、处理组B在贮藏中后期可显著减缓大黄鱼盐溶性蛋白溶出比下降，这倪渠峰等［27］的研究结果较一致。在低温载体流化冰贮藏条件下，蛋白质受微生物污染分解变性程度得到抑制，从而减缓了大黄鱼蛋白质变性程度。此外，盐溶性蛋白溶出比的降低也与巯基氧化成二硫键有关，本研究中处理组采用的柠檬醛-壳聚糖复合膜具备一定的阻氧性，可降低巯基的氧化作用，从而抑制盐溶性蛋白溶出比的降低。酸价的变化能反映水产品脂肪水解程度。本研究中，柠檬醛-壳聚糖复合膜具有一定抑菌及阻氧性，可减缓蛋白质受微生物作用水解及脂肪氧化酸败程度，有研究表明蛋白质水解及脂肪水解酸败呈一定正相关性，对照图5中盐溶性蛋白溶出比的变化趋势，进一步验证了该结论。脂肪氧化是水产品品质劣化的重要原因之一［28］。陈士达等［29］采用茶多酚、冷盐水浸泡、液氮冻结等方法对大黄鱼进行预处理并冷藏保鲜，研究指出，与其他处理组比较，茶多酚预处理组可有效降低大黄鱼贮藏期TBARS，这可能与茶多酚的抗氧化能力有关。本研究中，柠檬醛具备一定的抗氧化性，柠檬醛-壳聚糖复合保鲜剂协同流化冰低温作用减缓其TBARS上升，另外壳聚糖涂膜具备一定的阻氧性，降低了大黄鱼表面氧气分压，也是其TBARS值上升幅度减缓的原因之一，而关于柠檬醛、壳聚糖对大黄鱼TBARS交互影响有待进一步研究。MDA含量是判断鱼肉脂肪氧化程度的指标之一［30］。本研究中，处理组A、处理组B在贮藏期内可显著抑制大黄鱼MDA上升，维持其较好的脂肪特性。这与张娟等［21］采用苹果枝条多酚处理草鱼贮藏期MDA的变化趋势一致。章斌等［31］研究柠檬皮提取所得精油具备一定抑菌及抗氧化性能，进一步表明柠檬醛-壳聚糖复合膜具有抑制大黄鱼贮藏期MDA的上升能力，同时其抑菌性也可能促进其抗氧性能的提升。另外，壳聚糖的浓度、大黄鱼样品尺寸大小、涂膜厚度也是影响氧气分压的因素，进而影响MDA值变化。

本研究中，1个主成分能较好地反映大黄鱼的品质变化，即跟踪测定的8个指标具有较大的相关及信息重叠性。第1主成分主要反映大黄鱼贮藏期间蛋白质变性及脂肪酸败程度，即大黄鱼蛋白质变性与脂肪氧化酸败及水解各指标均有高度相关性，这与赵宏强等［32］关于应用超高压处理对鲈鱼片进行冷藏，其样品TBARS值、TVB-N值、菌落总数呈正相关的报道一致。得分系数表示各个指标对主成分的影响程度，本研究中拟定的线性回归函数可为大黄鱼综合保鲜效果评价提供参考。

4 结论

1）与对照组相比，处理组A、处理组B可有效延缓pH值、挥发性盐基氮、菌落总数、K值、酸价、TBARS值及MDA含量上升，同时可显著抑制大黄鱼盐溶性蛋白溶出比下降（P<0.05），且贮藏中后期，处理组B效果显著优于处理组A（P<0.05）。处理组B可有效维持大黄鱼低温贮藏品质，较对照组而言可延长货架期约6 d。

2）通过对8个指标进行主成分分析可知，pH值、挥发性盐基氮、菌落总数、K值、酸价、TBARS值、MDA含量指标间呈正相关性，上述指标均与盐溶性蛋白溶出比呈负相关，且有统计学意义（P<0.05）。8个检测指标可降维为1个主成分，其方差贡献率达91.440%，能较好地反映大黄鱼贮藏期的品质变化。