狼疮性肾炎病人血清簇分化抗原36、微小RNA-335水平与疾病活动度的关系

杜鹏举，郭琴，潘春勤，刘杰

系统性红斑狼疮（SLE）是一种能够引起多系统、多脏器功能受损的免疫性疾病，好发于20～40岁育龄期妇女［1］。狼疮肾炎是SLE 最常见的并发症之一，主要是由于SLE 过程中产生的自身免疫性抗原-抗体复合物沉积在肾脏中造成的损害所致，临床表现为血尿、蛋白尿、水肿等［2］。簇分化抗原36（CD36）是一种清道夫受体，广泛存在于多种组织细胞中，在自身免疫反应、炎症反应、脂质代谢中有重要作用［3-4］。研究表明CD36 与慢性肾脏病的发生发展有关［5］。微小RNA（miRNA）是一种内源性的非编码RNA，与自身免疫性疾病的发生发展有关［6］。Perez-Hernandez 等［7］研究表明与健康对照组比较，狼疮肾炎病人尿液外泌体中微小RNA-335（miR-335）表达显著上调。狼疮肾炎病人不同疾病活动度评分，决定不同剂量激素的使用及不同免疫制剂的选择。本研究通过检测狼疮肾炎病人血清CD36、miR-335 水平，分析二者与狼疮肾炎病人疾病活动度的关系，可能为临床狼疮肾炎疾病活动度的诊断提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取仙桃市第一人民医院2017 年5 月至2020 年6 月收治的SLE 病人138 例为研究对象，其中男42 例，女96 例，年龄（31.26±9.85）岁，范围为18～51岁，体质量指数（BMI）为（24.28±3.12）kg/m2；同期选取在该院进行健康体检人员120 例为对照组，其中男43 例，女77 例，年龄（32.45±9.12）岁，范围为18～50岁，BMI为（23.65±2.68）kg/m2。两组性别、年龄、BMI比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

纳入标准：（1）符合中国狼疮肾炎诊断和治疗指南编写组制定的狼疮肾炎诊断标准［8］；（2）经穿刺活检确诊；（3）≥18 岁。排除标准：（1）合并类风湿性关节炎等其他自身免疫性疾病病人；（2）妊娠期及哺乳期妇女；（3）合并恶性肿瘤病人；（4）合并心、肝等重大脏器功能不全者。

所有研究对象或其近亲属签署知情同意书，本研究经仙桃市第一人民医院伦理委员会审核、批准后实施（批号20170523）。

1.2 主要试剂及仪器RNA 提取试剂盒（货号DP419），天根生化科技（北京）有限公司，逆转录试剂盒（货号RR047A）、实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）试剂盒（货号RR820B），日本Takara 公司；酶联免疫吸附测定（ELISA）CD36 试剂盒（货号ab267614），英国abcam 公司；引物，生工生物工程（上海）股份有限公司；qRT-PCR 仪CFX96，美国BIO-RAD 公司；Nanodrop one 2000 分光光度计，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 血液样品采集 狼疮肾炎病人于住院次日清晨，健康体检者于体检当日清晨采集空腹静脉血3 mL，置于离心管中，4 ℃，3 000 r/min，离心10 min，转移上清并分装至新离心管中，-80 ℃超低温冰箱保存用于后续实验。

1.3.2 一般资料收集及实验室指标检测 收集狼疮肾炎病人性别、年龄、BMI 及SLE 疾病活动指数（SLEDAI）评分。采用全自动生化分析仪检测狼疮肾炎病人血清白蛋白、血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白；全自动特定蛋白分析仪检测C 反应蛋白（CRP）、补体C3、补体C4；血细胞自动分析仪检测白细胞、红细胞沉降率（ESR）；全自动尿沉渣定量分析仪检测尿沉渣红细胞数。

1.3.3 狼疮肾炎疾病活动度分组 根据ISN/RPS 关于狼疮肾炎活动评分系统分级法［9］对肾小球、肾小管进行定量评分，活动指数为肾小球、肾小管各项指标之和。根据活动指数将狼疮肾炎病人分为非活动组（0～4 分）46 例，活动组92 例，其中轻度组（＞4～8 分）29 例，中度组（＞8～12 分）37 例，重度组（＞12分）26例。

1.3.4 qRT-PCR 检测血清miR-335 的水平 RNA提取试剂盒对血清RNA 进行提取，逆转录试剂盒将提取的RNA 逆转录成互补DNA（cDNA），qRT-PCR检测血清miR-335 水平，循环条件为：95 ℃60 s；95 ℃30 s，58 ℃45 s，72 ℃30 s，共40 个循环。以U6 为内参，引物序列：miR-335 正向引物5’-3’为AGCCGTCAAGAGCAATAACGAA，反向引物5’-3’为GTGCAGGGTCCGAGGT；U6 正向引物5’-3’为GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，反向引物5’-3’为CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。采 用2-ΔΔCt法计算血清miR-335相对表达量。

1.3.5 ELISA 检测血清CD36 水平 利用ELISA 试剂盒检测所有受试者血清CD36 的水平，实验操作严格按照试剂说明书进行。

1.4 统计学方法采用软件SPSS 20.0 进行数据分析，符合正态分布计量资料采用± s 描述，两组间比较采用两独立样本t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组间的两两比较采用SNK-q检验；不符合正态分布计量资料采用中位数（下、上四分位数）［M（P25，P75）］描述，组间比较采用Mann-Whitney U 检验。计数资料采用例数描述，组间比较采用χ2检验；Pearson 相关性分析检验狼疮肾炎病人血清CD36、miR-335与一般资料的相关性；受试者工作特征曲线（ROC 曲线）分析血清CD36、miR-335 对狼疮肾炎疾病活动度的诊断价值，联合诊断与CD36、miR-335 对狼疮肾炎疾病活动度诊断价值的比较采用Z检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受试者血清CD36、miR-335 水平比较与对照组比较，狼疮肾炎病人血清CD36、miR-335水平均显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组血清中CD36、miR-335水平比较/± s

表1 两组血清中CD36、miR-335水平比较/± s

注：CD36为簇分化抗原36。

组别对照组狼疮肾炎组t值P值例数120 138 CD36/（μg/L）67.49±8.64 147.25±11.43 62.48＜0.001 miR-335 1.00±0.00 1.58±0.23 27.62＜0.001

2.2 不同疾病活动度狼疮肾炎病人一般资料比较与非活动组比较，活动组狼疮肾炎病人性别、年龄、BMI、白细胞、CRP、ESR 比较差异无统计学意义（P＞0.05）；尿素氮、血肌酐、24 h尿蛋白、尿沉渣红细胞、SLEDAI、活动指数均显著升高，补体C3、C4、白蛋白显著降低（P＜0.05）。见表2。

2.3 不同疾病活动度狼疮肾炎病人血清CD36、miR-335 水平比较与非活动组比较，活动组狼疮肾炎病人血清CD36、miR-335 水平均显著升高，且随着疾病活动度的增加，血清CD36、miR-335 水平均逐渐升高（P＜0.05），见表3。

表3 不同疾病活动度狼疮肾炎病人血清CD36、miR-335的比较/± s

表3 不同疾病活动度狼疮肾炎病人血清CD36、miR-335的比较/± s

注：CD36为簇分化抗原36。①与非活动组比较，P＜0.05。②与轻度组比较，P＜0.05。③与中度组比较，P＜0.05。

组别非活动组轻度组中度组重度组F值P值例数46 29 37 26 CD36/（μg/L）128.49±3.65 135.42±2.98①146.71±3.19①②157.36±4.12①②③441.40＜0.001 miR-335 1.32±0.11 1.44±0.14①1.60±0.15①②1.72±0.18①②③53.02＜0.001

2.4 血清CD36、miR-335 水平与狼疮肾炎病人一般资料的相关性Pearson 分析结果表明，血清CD36、miR-335 水平均与狼疮肾炎病人白细胞、CRP、ESR、尿素氮无关（P＞0.05），与白蛋白、补体C3、C4呈负相关，与血肌酐、尿蛋白、尿沉渣红细胞、SLEDAI、活动指数呈正相关（P＜0.05），见表4。

表2 不同疾病活动度狼疮肾炎病人一般资料比较

表4 血清CD36、miR-335水平与狼疮肾炎病人一般资料的相关性

2.5 ROC 曲线分析血清CD36、miR-335 水平对狼疮肾炎病人疾病活动度的诊断价值结果显示，血清CD36、miR-335 水平诊断狼疮肾炎病人疾病活动度的曲线下面积（AUC）分别为0.83［95%CI：（0.75，0.90）］、0.80［95%CI：（0.73，0.88）］，二者联合诊断AUC 为0.94［95%CI：（0.90，0.98）］，联合诊断对狼疮肾炎病人疾病活动度的诊断价值高于CD36、miR-335，见表5。

表5 血清CD36、miR-335水平对狼疮肾炎病人活动度的诊断价值

3 讨论

SLE 是一种多系统损伤的慢性自身免疫性疾病，发病机制比较复杂，与遗传、环境、感染等多种因素有关［10］。狼疮肾炎是SLE常见的器官损伤并发症，50%～80%的SLE 病人会出现肾损伤，可在5 年内发展为终末期肾病，严重威胁病人健康［2］。疾病活动度是影响狼疮肾炎病人肾脏预后的重要因素，对狼疮肾炎病人疾病活动度的早期评价对改善病人预后至关重要。肾组织活检是诊断狼疮肾炎最有效的方法，可以判断狼疮肾炎病人病理类型及疾病活动度，然而肾组织活检属于有创性检测手段，不能重复进行检测［11］。因此寻找有效的检测狼疮肾炎病人疾病活动度的生物标志物，有利于临床上判断狼疮肾炎病人的疾病进展，从而针对病人病情进行有效治疗，改善病人预后。

CD36是一种多功能受体，是细胞表面的一种单链跨膜糖蛋白，也是肾脏脂肪酸摄取系统的主要组成成分，在慢性肾脏疾病的发展中有重要的作用，有研究表明在患有急性或慢性损伤的肾脏中CD36水平显著升高［12-13］。本研究结果表明狼疮肾炎病人血清CD36 水平显著高于对照组，且狼疮肾炎活动组病人血清CD36 水平显著高于非活动组，并随着疾病活动度的升高而升高，提示CD36 可能与狼疮肾炎的发生发展有关。补体是血清中具有酶活性的一种球蛋白，与先天性免疫有关，补体C3和C4水平的降低表明补体活化功能异常，被认为是狼疮肾炎疾病活动度增加的指标［14］。Bonegio 等［15］研究表明沉积的免疫复合物能够激活补体吸引中性粒细胞并增强其反应，引起SLE肾脏受累。尿蛋白、尿沉渣水平与肾脏病变程度有关。本研究结果表明与非活动组比较，活动组狼疮肾炎病人尿素氮、血肌酐、尿蛋白、尿沉渣红细胞、SLEDAI、活动指数均显著升高，而补体C3、C4、白蛋白显著降低。研究表明CD36 通过影响嗜中性粒细胞的功能和先天性免疫反应，在狼疮肾炎的发病和发展中发挥重要作用［12］。Pearson 相关性分析结果表明，狼疮肾炎病人血清CD36 水平与白蛋白、补体C3、C4 呈负相关，与血肌酐、尿蛋白、尿沉渣红细胞、SLEDAI、活动指数呈正相关，提示CD36 可能通过病人体内免疫反应和炎症反应参与狼疮肾炎的发病。5A 肽是一种拮抗CD36 的新型肽，研究表明5A 肽可改善肾脏炎症和肾小管间质纤维化［16］。Yang 等［17］研究表明CD36的沉默通过抑制炎性应激诱导的脂肪酸摄取和脂质毒性抑制肥胖小鼠慢性肾脏病的发展。本研究ROC 曲线分析表明CD36 诊断狼疮肾炎疾病活动度具有较高的灵敏度和特异度，提示CD36 可能是诊断狼疮肾炎疾病活动度潜在的生物标志物。

狼疮肾炎病人存在着多种miRNA 的差异性表达［18］，miR-335 是一种与脂质形成有关的miRNA，与脂肪酸代谢和脂肪形成有关，在多种免疫性疾病中存在差异表达。Ebrahimiyan 等［19］研究表明与健康对照组比较，类风湿关节炎病人外周血单个核细胞中miR-335 水平显著上调。Martini 等［20］研究表明原发性干燥综合征miR-335-5p 表达显著高于健康志愿者。本研究结果发现狼疮肾炎病人血清miR-335水平显著高于对照组，与Perez-Hernandez 等［7］研究结果相似，miR-335 与狼疮肾炎病人补体C3、C4、尿蛋白、尿沉渣、SLEDAI、活动指数有关，提示miR-335 可能与狼疮肾炎的发病有关，具体机制需要进一步研究。本研究结果还发现狼疮肾炎活动组血清miR-335 水平显著高于非活动组，且随着病人疾病活动度的升高，血清miR-335水平显著升高，进一步ROC 曲线分析结果表明，miR-335 对狼疮肾炎病人疾病活动度有较高的诊断价值，提示miR-335 可能是狼疮肾炎发生发展的潜在诊断标志物。本研究利用血清miR-335 与CD36 水平对狼疮肾炎疾病活动度进行联合诊断，结果发现联合诊断狼疮肾炎的灵敏度和特异度均高于二者分别诊断，提示血清miR-335 和CD36 联合诊断可能是狼疮肾炎疾病活动度诊断的潜在方法。

综上所述，血清CD36、miR-335 在狼疮肾炎病人血清中存在差异性表达，与病人疾病活动度有关，对狼疮肾炎疾病活动度有一定的诊断价值。然而本研究仅从临床水平上探讨了CD36、miR-335 在狼疮肾炎病人血清中的表达差异，而CD36、miR-335在狼疮肾炎发生发展中具体作用机制还需进一步深入探讨。