多阶段采样分析颠茄草特征成分变化规律及最佳采收期

冯言颜，熊维政，李磊，郭立，郭军霞

(1.河南中医药大学药学院，郑州 450046；2.河南羚锐制药股份有限公司工程技术中心，信阳 465550)

颠茄草为茄科植物颠茄(AtropabelladonnaL.)的干燥全草，20世纪30年代从欧洲引入我国，目前全国多个地区均有种植，主要分布在山东、湖南、河南及浙江等地[1-3]。市场上流通的颠茄草药材大多为一年生的栽培品，各产地由于气候条件不同其生长规律与有效成分积累存在一定的差异，采收时间不一致，如陕西属北亚热带湿润气候，年平均温度15.1 ℃，降水量较多，该产地颠茄药材在4月初移栽，9月中旬采收[4-5]；湖南属亚热带季风湿润气候，年平均气温一般为16～19 ℃，春夏多雨，秋冬干旱，该产地颠茄药材一年种植两茬，春种颠茄3月初移栽，当年6月中下旬采收，秋种颠茄9月下旬移栽，次年6月中下旬采收[2]。河南属暖温带至亚热带、湿润至半湿润季风气候，年平均气温一般为12～16 ℃，雨水多集中在夏季，该产地在驻马店、信阳及周口等多个地区均有种植颠茄草，分为春种和秋种两种模式，其中以秋季种植为主，但由于颠茄草引种时间不长，在种植采收方面缺乏系统化、标准化的模式，部分地区种植方式及采收时间不一致，存在混批次药材质量不稳定的现象，因此，研究影响该地区颠茄草质量的相关因素很有必要[6]。

颠茄草中的有效成分主要为生物碱类化合物，具有镇痛、解痉的药理作用，主要用于制备其中间体颠茄浸膏和颠茄流浸膏[7]。2020年版《中华人民共和国药典》一部规定其常用中间体含量控制指标均为硫酸天仙子胺和东莨菪内酯，而颠茄草药材仍是通过酸碱滴定法测定总生物碱含量，该方法不仅操作繁琐，误差较大，且与其中间体含量测定指标不同，不利于产品质量控制[7-8]。因此本实验针对河南秋季种植的颠茄草进行研究，采用高效液相色谱(HPLC)法，以硫酸天仙子胺和东莨菪内酯为含量测定指标，测定不同采收时间、不同部位颠茄草中2种特征成分的含量，并与全国20个产地颠茄草药材作对比，为河南秋种颠茄草合理采收及颠茄草质量标准提高提供科研资料，同时也为颠茄草优良种质筛选奠定一定的理论基础。

1 仪器与试药

1.1仪器 LC-2010AHT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；DHG-9075A电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；114B摇摆式高速中药粉碎机(瑞安市永历制药机械有限公司)；MS304S电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司，感量：0.1 mg)；KQ-600 VDE双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2样品与试剂 课题组于2020年6—10月进行颠茄草产地调研，收集河南罗山、河南新县、河南光山、河南西华、河南固始、河南正阳、山东莱州、山东沂南、山东蓬莱、山东牟平、湖南新田、湖南株洲、江西赣州、江西彭泽、江西上高、新疆库尔勒、黑龙江穆棱、湖北孝昌、陕西旬阳和陕西汉阴共20个产地颠茄草样品。其中不同采收时间及不同部位颠茄草样品采自河南羚锐制药中药材种植基地，自2020年5月21日—7月14日每隔约10 d采样1次，共采样6次，同时将2020年6月21日采集的颠茄草样品分为全草、根、茎、叶和果实。经河南中医药大学王裕铭教授鉴定，均为茄科植物颠茄(AtropabelladonnaL.)。

硫酸天仙子胺(批号：620-61-1，含量≥98%)购于北京中科质检生物技术有限公司；东莨菪内酯(批号：110768-200504，含量≥98%)购于中国食品药品检定研究院；色谱级甲醇(赛默飞世尔科技有限公司)；色谱级乙腈(赛默飞世尔科技有限公司)；超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1颠茄草中硫酸天仙子胺和东莨菪内酯的含量测定

2.1.1溶液的制备 对照品溶液的制备：精密称定硫酸天仙子胺，用50%甲醇作溶剂配成0.25，0.50，1.00，2.00，4.00，8.00 mg·mL-1标准溶液；精密称定东莨菪内酯，50%甲醇作溶剂配成18.764，37.528，75.055，150.11，300.22，600.44 μg·mL-1标准溶液。供试品溶液制备：精密称定颠茄草中粉2 g(粉末过筛孔内径0.25 mm)，50%甲醇50 mL置于100 mL锥形瓶中，称定质量，超声处理30 min(功率400 W，频率58 kHz)，放冷后再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.2色谱条件 硫酸天仙子胺色谱条件：Ultimate XB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.25%十二烷基磺酸钠的0.004%磷酸溶液(40：60)，等度洗脱；体积流量：1.0 mL·min-1；检测波长：210 nm；柱温：40 ℃；进样量：10 μL。

东莨菪内酯色谱条件：Ultimate XB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：A为甲醇，B为0.05%磷酸溶液，梯度洗脱(0～5 min，3%～15%A；5～60 min，15%～60%A)；体积流量0.8 mL·min-1；检测波长344 nm；柱温35 ℃；进样量10 μL。

2.1.3方法学验证

①专属性实验：按照“2.1.2”项色谱条件进样分析，得到对照品和颠茄草样品的HPLC色谱图，见图1。结果表明硫酸天仙子胺和东莨菪内酯色谱峰分离度高、专属性强。

②精密度实验：分别精密吸取硫酸天仙子胺和东莨菪内酯对照品溶液10 μL，在“2.1.2”项色谱条件下连续进样6次，测得硫酸天仙子胺和东莨菪内酯峰面积RSD值为0.35%，0.31%，表明仪器精密度良好。

③线性关系考察：分别精密吸取硫酸天仙子胺、东莨菪内酯对照品溶液在“2.1.2”项色谱条件下进样。以峰面积为纵坐标(Y)，以溶液质量浓度为横坐标(X)进行回归，得回归方程，见表1。硫酸天仙子胺和东莨菪内酯在表1测定范围内线性关系良好。

表1 硫酸天仙子胺和东莨菪内酯线性关系考察结果 Tab.1 Linear relationship results of hyoscyamine sulfate and scopoletin

④重复性实验：取同一批次样品，按“2.1.1”项下方法制备6份供试品溶液，在“2.1.2”项色谱条件下进样，得到硫酸天仙子胺和东莨菪内酯含量RSD值分别为0.91%，1.24%，表明该方法重复性良好。

⑤稳定性实验：对“2.1.3 ④”项中制备的同一份供试品溶液，分别在0，0.5，1，2，4，8，16，24 h取样，在“2.1.2”项色谱条件下进样分析，测得硫酸天仙子胺和东莨菪内酯峰面积RSD分别为1.20%，1.03%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

A.硫酸天仙子胺对照品；B.颠茄草样品+硫酸天仙子胺；C.东莨菪内酯对照品；D.颠茄草样品+东莨菪内酯；1.硫酸天仙子胺；2.东莨菪内酯。图1 对照品及颠茄草样品HPLC色谱图 A.hyoscyamine sulfate reference substance；B.belladonna sample+hyoscyamine sulfate；C.scopoletin reference substance；D.belladonna sample+scopoletin；1.hyoscyamine sulfate；2.scopoletin.Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance and belladonna sample

⑥加样回收率实验：精密称取含量已知的样品6份，每份1 g，精密加入相当于1 g药材含量的对照品，按照“2.1.1”项中的方法制备供试品溶液，在“2.1.2”项条件下测定硫酸天仙子胺和东莨菪内酯含量，计算加样回收率。结果见表2。

表2 硫酸天仙子胺、东莨菪内酯加样回收率测定结果 Tab.2 Test results of sample recovery rate of hyoscyamine sulfate and scopoletin

2.1.4数据处理与分析 实验采用IBM SPSS Statistics 20版、Origin85版、Excel2010版软件对数据进行处理，并通过系统聚类法对不同产地药材进行聚类分析。

2.2河南秋种颠茄草不同采收时间两种特征成分变化规律 从2020年5月21日颠茄草开花开始在河南羚锐制药中药材种植基地采样，每批次采集3份，每份随机采集5株，烘干，每份5株，分别称质量后取平均值，用SPSS软件处理3份药材干质量平均值得到单株干质量及标准差；将3份药材分别粉碎成中粉，按照“2.1.2”项下方法测定含量，用SPSS软件处理得到含量均值及标准差；每份药材单株干质量与含量的乘积即单株总量。

根据表3中结果，河南秋季种植颠茄草从2020年5月21日—7月14日单株干质量逐渐增加，2020年6月21日干质量达到最大值373.62 g，之后略有降低；硫酸天仙子胺和东莨菪内酯含量呈现“先增后减再增”的趋势，硫酸天仙子胺在2020年6月11日含量最高，为2.606 mg·g-1，2020年6月21日略有降低；东莨菪内酯含量在2020年6月21日含量最高，为0.333 mg·g-1；2020年6月21日后2种成分含量急剧下降，而2020年7月14日2种特征成分再次升高，这可能与果实成熟有关。单株药材硫酸天仙子胺总量在2020年6月11日最高，单株药材东莨菪内酯总量在2020年6月21日最高，综合考虑不同采收时间样品干质量及2种特征成分含量积累规律确定河南秋种颠茄在6月中旬采收为宜。

表3 不同采收时间河南秋种颠茄草2种特征成分含量测定结果 Tab.3 Determination results of two characteristic components in Henan autumn belladonna at different harvest times

2.3河南秋种颠茄草不同部位中2种特征成分含量 于2020年6月21日在河南羚锐制药股份有限公司中药材种植基地随机采集颠茄草样品3份，每份15株，烘干后称质量，将各部位分开后粉碎并称质量，测定含量，按各部位质量率(%)取样100 g，混匀后测定全草含量。各部位对全草贡献率(%)=(单个部位含量×单个部位质量)/(全草含量×全草质量)×100%。

根据表4、图2结果可知，河南秋种颠茄草不同部位中，颠茄果实中硫酸天仙子胺和东莨菪内酯含量最高，分别为4.590，0.626 mg·g-1，但由于全草中不同部位生物量分配不同，硫酸天仙子胺和东莨菪内酯整体贡献值为：叶>茎>果>根，因此在采收时应尽量保持叶片的完整性，这也与不同生长期两种成分积累规律相一致，预示颠茄在6月中旬成熟后应尽快采收，避免叶子脱落而降低药材质量。

图2 河南秋种颠茄草各部位含有的硫酸天仙子胺(左)及东莨菪内酯(右)对全草的贡献率 Fig.2 Contribution percentage of hyoscyamine sulfate(left) and scopoletin(right) contained in each part to the whole plant of Henan autumn belladonna

表4 河南秋种颠茄草不同部位含量测定结果 Tab.4 Content determination results in different parts of Henan autumn belladonna

2.4不同产地颠茄草特征成分比较 测定全国20个产地颠茄草平均单株干质量、硫酸天仙子胺及东莨菪内酯含量，并对单株颠茄草药材中两种特征成分总量进行比较分析，根据单株药材总量对不同产地颠茄草进行系统聚类分析，结果见表5、图3、图4。

图3 不同产地颠茄草单株药材硫酸天仙子胺和东莨菪内酯总量比较 Fig.3 Comparison of the total amount of hyoscyamine sulfate and scopoletin in a single plant of belladonna from different origins

图4 不同产地颠茄草系统聚类图 Fig.4 System clustering diagram of belladonna from different origins

表5 不同产地颠茄草的特征 Tab.5 Characteristics of belladonna from different origins

由结果可知全国不同产地颠茄草单株干质量、硫酸天仙子胺和东莨菪内酯含量及单株总量均存在差异。单株干质量平均值为370.35 g，山东沂南单株干质量最大为501.97 g，黑龙江穆棱单株干质量最小为295.67 g；硫酸天仙子胺含量平均值为1.914 mg·g-1，单株药材硫酸天仙子胺总量平均值为715.99 mg，河南新县总量最高(1049.74 mg)，江西彭泽总量最低(333.67 mg)；东莨菪内酯含量平均值0.238 mg·g-1，单株药材东莨菪内酯总量平均值为86.44 mg，江西上高总量最高，为158.34 mg，江西彭泽总量最低，为39.49 mg。根据聚类分析树状图，可将全国20个产地颠茄草分为4类，第①类包括山东蓬莱、湖南新田、河南正阳、湖南株洲及山东莱州5个种质，该类群硫酸天仙子胺含量较高，东莨菪内酯含量较低；第②类包括河南罗山、山东牟平、河南固始、河南新县、河南光山及山东沂南6个种质，该类群硫酸天仙子胺和东莨菪内酯含量均较高；第③类包括黑龙江穆棱、湖北孝昌、陕西旬阳、陕西汉阴、河南西华及江西彭泽共6个种质，该类群硫酸天仙子胺和东莨菪内酯含量均较低；第④类包括江西赣州、江西上高及新疆库尔勒共3个种质，该类群硫酸天仙子胺含量较低，东莨菪内酯含量较高。

由分类结果可知，河南秋种颠茄草多集中在第②类，药材质量较好。

3 讨论

颠茄草非传统中药材，其饮片在中医临床处方上使用较少。现主要用作生产其中间体颠茄浸膏和颠茄流浸膏。据不完全统计，国内生产含颠茄浸膏和颠茄流浸膏的制剂有20多个品种，200多家制药企业，240多个注册批准文号。目前颠茄浸膏和颠茄流浸膏出口量呈上升趋势，国内需求也在不断增加，然而颠茄草在种植时具有不能重茬的特性，不同产地环境下采收时间也不一致，其产量和质量较难稳定[9]。因此，颠茄草在良种选育、种植采收及质量研究等方面都亟需研究。

对河南秋种颠茄草进行多阶段采样分析并将其与其他产地颠茄药材进行对比，可为颠茄相关产业发展与资源合理开发利用提供一定的理论依据。在研究过程中，实验考察了渗漉、超声及回流提取对颠茄草中硫酸天仙子胺及东莨菪内酯含量的影响，发现超声和渗漉提取率相当，回流提取率较低，由于渗漉实验周期较长，故本实验采用的是超声法。实验还考察了不同粒度(最粗粉、粗粉、中粉、细粉)颠茄粉末超声处理对2种特征成分含量的影响，发现中粉超声30 min 后提取率较高。

根据研究结果及颠茄草生长状态观察，河南秋种颠茄草从5月下旬至6月上旬为快速生长期，植株干质量倍增，有效成分快速积累；6月中旬进入成熟期，植株干质量及有效成分积累均达到峰值；6月下旬开始进入完熟及枯黄期，植株干质量减少，有效成分含量呈现“先减后增”的趋势，但增加之后仍低于峰值，原因可能是此阶段种子逐渐成熟，成熟的种子极易掉落，同时植株下部叶子逐渐枯黄脱落，至7月初时叶子仅剩顶部少许，根据颠茄草不同部位对全草有效成分贡献量(叶>茎>果>根)可知，叶子脱落对颠茄草药材质量影响较大。综合研究结果来看，河南秋种颠茄草6月中旬采收为宜，采收时应注意保持叶片完整性，避免其脱落影响药材质量。

不同产地颠茄草有效成分含量差异较大，原因可能与产地环境、田间管理方式、采收时间及引种品种四个方面有关。不同产地土壤、海拔及气候环境等不同会影响药材有效成分积累规律。不同产地种植户在田间施肥、病虫害防治等管理方式上的差异会影响药材生长方式及代谢产物。合理的采收时间也是影响颠茄药材质量的重要因素，采收过早，颠茄草植株小且有效成分含量低，质量较差，采收过晚，颠茄草种子已全部成熟，会出现种子、叶子大量掉落，根部萎缩腐烂等情况，这些都直接影响颠茄草的产量和质量。此外，由于颠茄草是从欧洲引种药材，有些地区引种的品种可能发生了退化，从而影响药材质量。为促进颠茄草相关产业链健康发展，在颠茄草种植过程中应进一步加强田间管理，规范采收、加工、运输及储存方式，保证药材质量。