栽培技术及栽培年限对铁棒锤药材质量的影响

倪鼎文，陈红刚

（1.兰州财经大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000）

铁棒锤为毛茛科乌头属植物，别名铁牛七、雪上一枝蒿、断肠草、黑乌草、榜那、庞阿那保[1]，分布于海拔2 000～3 700 m 的山坡草地、林缘或疏林下，药用部位为块根，味微苦、辛，性热，有大毒，主要含有乌头碱、去氧乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等，具有活血化瘀、止痛消肿、解热等作用，用于治疗跌打损伤、风湿关节痛、牙痛等[2]。

随着铁棒锤药理学研究的深入及药用价值的挖掘，其用途愈显广泛，除了铁棒锤相关药品的开发之外，铁棒锤提取物在一些杀虫剂、灭鼠剂等生物农药的开发方面效果明显[3-4]。目前铁棒锤药材主要来源于野生，但仅靠野生资源已无法满足市场用药的需求，且无节制的采挖容易导致野生资源的灭绝，为了保护有限的野生资源和对现有资源进行合理的开发利用，开发新的药源成了解决铁棒锤资源匮乏的必然选择。近年来，甘肃、宁夏等地尝试了铁棒锤的人工驯化栽培[5-7]，也进行了利用现代生物技术生产铁棒锤药材的探索[8-9]，但人工生产铁棒锤药材质量的研究报道较少。本研究以乌头碱为指标性成分，考察不同栽培技术及栽培年限对铁棒锤药材质量的影响，旨在为铁棒锤的规范化栽培及资源保护及开发利用提供依据。

1 材料

1.1 铁棒锤药材

铁棒锤种子来源于甘肃中医药大学和政药用植物园，经甘肃中医药大学杜弢教授鉴定为毛茛科乌头属植物铁棒锤种子，铁棒锤种苗为和政药用植物园种子育苗后统一提供，移栽所用种苗大小一致，田间管理方法相同，药材采挖后去除杂质、阴干保存，不定根由组织培养方法获得，生产周期140 d[10-12]。样品信息详见表1。

1.2 试验地概况

大田试验在甘肃省和政县甘肃中医药大学和政药用植物园进行，海拔2 400 m，年平均气温5.8 ℃，年降雨量592.7 mm，无霜期111 d，年日照数约2 150～2 400 h。土壤为黑垆类，pH 为7.44，有机质4.16%，全氮0.267%，全磷0.106%，全钾2.17%，水解氮194.25 mg/kg，速效磷26.7 mg/kg，速效钾158 mg/kg，地块平整，肥力均匀，土壤熟化程度高。

1.3 仪器

Aglient1200 高效液相色谱仪（G1311C 型四元梯度泵、G1315D 型二级管阵列检测器（DAD、G1316A型柱温箱、G1329B 型自动进样器、Chemstation 色谱工作站），Phenomenxe Luna 5u C18（250×4.6 mm）色谱柱，HH-S24 电热恒温水浴锅（江苏大地自动化仪器厂），超声波清洗器（上海新苗医疗器械制造有限公司BX7200HP，十万分之一电子天平(奥豪斯仪器（上海）有限公司JB/T 5374-1991）。

1.4 试剂

氨水、异丙醇、乙酸乙酯、乙酸铵、三氯甲烷为分析纯，乙腈、四氢呋喃为色谱纯。标准品：乌头碱（上海源叶生物科技有限公司Z06F6B1）。

2 方法

2.1 样品制备

分别称取不同来源过二号筛的铁棒锤粉末0.5 g，放置于50 ml 的锥形瓶中，加入氨试液0.75 ml，异丙醇和乙酸乙酯（1∶1）的混合液13 ml，密封。在频率59 kHz、温度25 ℃条件下超声提取40 min，抽滤，取滤液6.5 ml 置于口径60 mm 的蒸发皿中，在40 ℃的恒温水浴锅中蒸干。蒸干后在残渣中加入异丙醇和三氯甲烷（1∶1）混合液溶解，定容到2 ml 容量瓶中，过0.45 m 的微孔滤膜，于4 ℃密封保存。

2.2 乌头碱含量测定

参照马学琴[13]、张帆[14]、杨金[15]等人的方法进行乌头碱含量的测定。色谱条件：采用phenomenxe Luna 5u C18（250×4.6 mm）色谱柱，以乙腈-四氢呋喃（25∶15）为有机相，以0.1 molL-1 醋酸铵溶液（加冰醋酸0.5 ml/1 000 ml）为水相，按表2 中规定进行梯度洗脱，检测波长为235 nm，柱温35 ℃，流速0.8 ml/min，理论板数按乌头碱峰计算应不低于5 000，进样量5μL。

表2 流动相洗脱梯度

2.3 数据分析

采用Microsoft Excel 2007 软件进行数据处理，使用SPSS 17.0 软件进行数据方差分析。

3 结果与分析

不同栽培技术及栽培年限铁棒锤药材质量差异见图1，B、C、D、E 来源的铁棒锤药材乌头碱含量高于A，说明二年生药材质量优于一年生药材；C 来源的药材乌头碱含量高于B（P＜0.05），说明相同的生长时间用子根繁殖的药材质量优于种子直播的药材；D来源的药材乌头碱含量高于C，说明打顶处理可以提高铁棒锤药材质量；C 来源的药材乌头碱含量高于E（P＜0.05），说明秋季采收的药材质量优于春季采收药材；F 来源的药材乌头碱含量低于C、D 来源药材，但高于A、B、E 来源药材，说明利用组织培养方法生产铁棒锤不定根是一种可行的铁棒锤药材生产方法。

图1 栽培技术及栽培年限对铁棒锤药材质量的影响

4 结论与讨论

铁棒锤为二年生药材，二年生药材质量优于一年生。铁棒锤可以通过种子直播及育苗移栽的方法种植，而育苗移栽生产的铁棒锤药材质量更好。打顶会使药材的叶面积及光合特性发生改变，抑制顶端优势，促进根系生长发育[16]，利于铁棒锤药材中乌头碱含量的积累，可提高铁棒锤药材质量。采收时令对药材本身的质量、疗效有直接的影响，所以合时合理地采收是保证药材质量的关键所在[17]，秋季采收的铁棒锤药材比春季采收的药材乌头碱含量更高，质量更好，可能是由于铁棒锤比较耐寒，在开春土壤解冻时，子根越冬芽已经开始生长，消耗了部分能量物质，导致铁棒锤药材中乌头碱含量下降，药材质量降低。

铁棒锤不定根培养技术虽然刚刚起步，繁殖效率较低，繁殖成本高于大田生产，但利用不定根培养生产次生产物具有生长周期短、条件可控、来源单一、遗传背景一致、经济方便、重复性强、效率高和可周年试验或生长等优点[18]。本研究中铁棒锤不定根中乌头碱含量高于A、B、E 来源药材，但低于C、D 来源药材，说明利用组织培养技术快速大量获得不定根，可以为铁棒锤野生资源保护及现有资源的开发利用提供一条可行的新途径，能够有效的解决铁棒锤野生资源不足，种植周期长及有效成分不稳定的问题，具有显著的生态效益及社会效益。