耐低温低氧水稻种质资源筛选

滕祥勇, 王金明， 李鹏志, 林秀云, 孙 强

(吉林省农业科学院水稻研究所, 吉林 公主岭 136100)

水稻直播是一种轻简型栽培方式，具有省工、省时和高效等特点，在单位面积穗数、千粒重两个方面，直播稻也比移栽稻更具丰产优势[1]。近年来，随着农业劳动力成本的升高，水稻直播被越来越广泛采用。我国开展水稻直播生产较晚，相应的研究起步也晚。目前用于水稻直播的品种都是水稻移栽生产中使用的品种，而在育秧移栽品种选育过程中以高产优质高效栽培为目标，对苗期性能特征没有要求。在直播稻生产过程中，全苗壮苗问题成为继草害、倒伏等目前直播稻发展的又一制约因素[2]。直播稻苗期生长主要受到低温胁迫、缺氧胁迫的影响[3]，通过选用耐逆境发芽能力(具有较强耐低温能力)和在短期淹水环境中能保持较强的发芽出苗能力(具有较强耐缺氧能力)的水稻品种，能提高直播水稻的田间成苗率[3]。

近年来，国内外学者对水稻耐低温低氧作了大量的研究。结果表明，耐低温低氧能力存在显著的品种间差异[4]，同时耐低温和耐低氧两性状间无明显关联[5]。张晓丽等[6]、曹微等[7]把耐低温与耐低氧作为2个独立性状进行研究。本研究通过模拟特定的低温低氧环境，对238份稻种资源进行低温、低氧、低温低氧复合胁迫、室内覆土及田间自然条件鉴定处理，筛选出一批耐低温低氧材料，并探索和建立一种有效的水稻耐低温低氧评价方法，为培育适合东北中部稻区直播稻品种提供材料基础与技术支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试材料为吉林省中、早熟品种、部分黑龙江第一积温带材料以及团队高世代材料共238份。试验在吉林省农业科学院水稻研究所进行。

1.2 仪器设备

恒温培养箱、光照培养箱、培养皿、滤纸、10×10格冷冻盒、1 mL移液枪、1 mL枪头、500 μL枪头、密封盒、塑料盆。

1.3 实验设计

1.3.1种子处理及种子发芽力检测

将种子放入50 ℃恒温培养箱处理48 h，打破休眠，使种子成熟度保持一致。

每个品种或株系随机取50粒，用75%酒精消毒10 min，蒸馏水冲洗干净，排列于铺有双层滤纸的培养皿(直径9 cm)中，30 ℃生化培养箱中湿润发芽。以胚根或胚芽超过半粒种子长为发芽标准，检测30 ℃下第5天的种子发芽率，以3次重复的种子发芽率平均数作为品种或株系的发芽率表型值，来判断各品种/株系种子的活力[8]。

1.3.2耐低温低氧鉴定

分初筛、精细室内鉴定、室内覆土试验、田间鉴定共4个部分。

1) 初筛：吉林省水稻直播的播种时期基本在5月中上旬，此时吉林省各地区的日均气温稳定在15 ℃左右，故本试验将15 ℃，2 cm水深作为初筛时低温低氧胁迫处理条件。具体处理如下：

每个品种或株系随机取100粒，用75%酒精消毒10 min，蒸馏水冲洗干净，排列于铺有双层滤纸的培养皿(直径9 cm)中，盖盖后将其放入种子箱内，缓慢向种子箱中注水，水面高度超培养皿盖1 cm(水深2 cm)。15 ℃处理10 d，调查其萌发情况，计算萌发率；然后将低温低氧胁迫处理10 d后的种子晒干，进行标准发芽试验，计算发芽率和发芽势。3次重复，每个重复100粒种子。

2) 精细室内鉴定：低温发芽试验为300粒种子，3次重复，每次重复100粒。放置于铺有两层滤纸的培养皿(直径9 cm)中，统一用移液枪加10 mL无菌超纯水，然后放入培养箱中培养。

培养条件为12 ℃，24 h黑暗处理，统计15 d后的发芽率。

从每个重复中随机选取50株，测量其幼芽和根的鲜重。随后105 ℃杀青，85 ℃烘干，测量其干重。最后计算发芽率、发芽指数和活力指数。

低氧发芽试验：100粒种子，2次重复，每次重复50粒。分别放入2个10×10格的冷冻盒中，每格5粒，每个材料放1行。用移液枪统一在每个格子中加5 mL无菌超纯水，确保每粒种子均被水覆盖。

以正常发芽条件为对照(和上面处理区别在于加水不同，正常发芽加水500 μL，低氧加水5 mL)。

所有处理后的冷冻盒放入铺有两层湿润滤纸的密封盒中，28 ℃恒温发芽，16 h光照/8 h黑暗。7 d后，测量胚芽鞘的长度，并统计发芽率及缺氧反应指数。10 d后测量苗高、叶片重等指标。

缺氧反应指数=缺氧条件下胚芽鞘长度/正常条件下胚芽鞘长度。

低温低氧复合发芽试验：28 ℃恒温催芽至破胸露白。选取破胸一致的种子均匀放置于塑料冷冻盒中，每格5粒，每个材料放1行(50粒)，2次重复，共100粒。每格加无菌超纯水5 mL，转入12 ℃光照培养箱，湿度75%，12 h光照/12 h黑暗条件下培养10 d，处理结束后，沥去多余的水，28 ℃正常条件下继续培养10 d，使幼芽恢复生长。

以正常处理的催芽种子为对照。统计正常苗数、计算成苗率、测量所有对照和处理正常苗的根长、根数、苗高、株鲜重、地上部鲜重和根鲜重。

3) 室内覆土试验：选取饱满无霉变种子，30 ℃光照培养箱蒸馏水浸种2 d，催芽2 d后播入塑料盆中，每盆播100粒，覆土(常规水稻土，过细筛)1 cm[9]，直尺量土层上面5 cm处作标记，补水至标记处，每天补水2次，维持5 cm土层淹水状态。3次重复，每天观察苗的长势并及时补充水分以保持土壤湿润；同时播干籽入塑料盆中，浇透底水，每日观察出苗并及时补充水分以保持土壤湿润，15 d后统计出苗数。胁迫温度15 ℃。

4) 田间鉴定：随大田直播同期进行，10 d开始统计其出苗数，每隔3 d统计一次。最终统计其出苗数、成苗数。

1.4 数据处理与统计分析

使用Excel软件进行数据处理，方差分析和多重比较使用SPSS软件进行。

2 结果与分析

2.1 种子发芽力检测

对238份供试材料进行标准发芽试验，其中有42份材料发芽力较差，选用196份发芽力达标材料开展耐低温低氧鉴定试验。

2.2 低温淹水初筛

一般认为，15～20 ℃是鉴定水稻低温发芽性的适宜温度指标。在此温度范围内，品种间对低温的反应差异能表现最显著。故为了观察品种间差异而进行的大量筛选试验，都以15 ℃为温度指标基准[10]。本研究中，15 ℃低温淹水胁迫对种子的萌发率、发芽率和发芽势均有一定程度的影响，其中对萌发率的影响最大。15 ℃低温淹水处理10 d后，所有供试材料的萌发率均低于80%，其中萌发率超60%的仅有37份，占全部供试材料数的18.88%，萌发率低于60%的有159份，占供试材料数的81.12%。解除胁迫处理后种子重新进行标准发芽试验表明，约95%的供试材料的发芽率未受明显影响，有51.53%的供试材料(101份)发芽率超95%，仅有9份材料的发芽率低于80%；43.36%供试材料的发芽势高于60%。最终，以萌发率≥40%，发芽率≥80%，发芽势≥60%为标准，初步筛选出59份材料进行精准鉴定。

2.3 室内鉴定

2.3.1低温发芽鉴定结果

以初筛后表现较好的59份材料进行12 ℃低温胁迫处理，其中有51份材料低温胁迫处理15 d后其发芽率高于60%，占供试材料的86.44%。51份材料的平均发芽率为77.65%，材料间发芽率变异系数为2.95，经初筛后入选材料整体低温发芽率较高，变异系数较小，这也表明利用15 ℃低温淹水进行大批量材料的初步筛选是有效的。

低温胁迫处理后，不同材料间芽长、根长差异显著，所有供试材料均表现为，根长长于芽长，根长的平均值为3.44 cm，是芽长平均值的1.66倍；50株幼苗平均鲜重为0.27 g，平均干重为0.17 g。通过比较发现，本研究中低温处理后的根长、芽长等要明显弱于前人研究中适温条件下同时期的水稻幼苗。表明低温胁迫可能对水稻幼苗地上部和地下部的生长都产生了显著的抑制作用。

低温下发芽率是目前在发芽期耐冷性鉴定中最常用的一种指标[11]，而发芽指数则反映发芽的快慢。从表1可知，低温胁迫处理下，材料间发芽指数、活力指数等指标的变化幅度较大，供试材料中发芽指数最高可达14.91，表现出较快的发芽速度。12 ℃低温胁迫下，7个指标的变异系数表现为：发芽指数>活力指数>发芽率>鲜重>干重>根长>芽长，说明经初筛后精准鉴定时，发芽指数和活力指数对于区别材料间的耐冷性更具有代表性。

表1 低温胁迫下各性状的平均值、最大值、最小值及变异系数Table 1 The average value，maximum value，minimum value and coefficient of variation of characteristics under low temperature stress

在59份供试材料中，低温发芽率超90%，发芽指数高于平均值的材料有12份，分别为W-1、W-14、W-32、W-39、W-82、W-91、Z-7、Z-36、Z-59、L-8、L-13、L-45，占供试材料的20.34%；23份材料发芽率超80%，占供试材料数的38.98%。芽长和根长均超过平均值的有21份，占供试材料的35.59%；发芽指数高于平均值的有21份，占供试材料的35.59%；活力指数高于平均值的有18份，占比30.51%。综合发芽率(>80%)、芽长、根长、发芽指数(高于平均值)和活力指数等指标，共筛选到较耐冷材料19份，其中，W-14、W-32、W-82、W-91、Z-36、Z-59、L-8、L-45等8份材料表现较强耐低温(表2)。

表2 19份耐冷性较好材料Table 2 19 materials with resistance to cold

2.3.2低氧发芽鉴定结果

已有研究表明，低氧条件下水稻种子萌发差异明显，耐低氧品种胚芽鞘能快速伸长突破水层表面，为幼苗和种子根的生长发育提供充足的氧气[12-16]。前人研究多以低氧胁迫下胚芽鞘的长度作为评价种质资源耐低氧指标[17-18]；而本研究中发现，低氧胁迫处理后材料的幼苗生长高度、胚芽鞘长度和发芽率3项指标差异明显。幼苗生长高度均值由7.3 cm降至4.0 cm，降低了45.21%。在5.0 cm水深下培养，水稻生长到第6天，仅有1份材料幼苗高于5.0 cm，苗顶端突破水层表面，不足总数的2%，第7天，有3份幼苗高于5.0 cm，约为总数的5%，到处理结束，共有13份材料幼苗超出水层，约占供试材料总数的22.03%。同时，在研究中发现，所有供试材料在前期(播后3～5 d)均表现较快生长；之后，材料间出现分化，部分材料幼苗继续快速生长，到后期顶端突破水面，从而吸收到充足的氧气，恢复正常生长；另一部分材料则一直表现为生长缓慢或停止生长，最终无法突破水面长期缺氧而死亡。

发芽率均值降低幅度最大，低氧胁迫后供试材料发芽率平均值仅为27.3%，远低于正常处理(89.4%)，差异显著。59份供试材料中有10份材料发芽率高于60%，平均发芽率为68.21%，而在正常处理条件下，该部分材料的平均发芽率为97.02%；低氧胁迫下，29份供试材料(约50%)发芽率低于20%，平均发芽率为7.12%，正常处理条件下，29份材料的平均发芽率为93%，两者差异极显著。低氧胁迫后，不同材料间发芽率差异明显，发芽率可以作为低氧耐性评价的一个参考指标。

低氧胁迫下，胚芽鞘较对照下降38.46%；43份供试材料的胚芽鞘长度较对照下降明显，16份材料的胚芽鞘与对照间无显著差异。缺氧反应指数看，大于1.0的材料占所有材料的8.47%(5份)，其中最大值达1.32。这5份材料的发芽率均超60%。29份低氧胁迫下平均发芽率低的材料缺氧反应指数均值为0.16。发芽率与缺氧反应指数间呈显著正相关，即低氧胁迫下发芽率越高的材料，其缺氧反应指数相对较高；发芽率越低，其缺氧反应指数相对较低。株高与缺氧反应指数也呈正相关，株高越高，其胚芽鞘越长，缺氧反应指数越大。而叶片数、叶片重等指标与缺氧反应指数无显著相关性(表3、表4)。

表3 不同胁迫处理对胚芽鞘等指标的影响Table 3 Effects of stress on coleoptiles indicators and so on

p<0.05)。下同。

表4 低氧胁迫处理下农艺性状相关性分析Table 4 Correlation analysis of main agronomic characters under hypoxia

低氧胁迫下，处理1为发芽率超60%材料；处理2为发芽率介于(20%～59%)之间材料；处理3为发芽率低于20%材料。

以低氧胁迫下胚芽鞘长度(与对照无显著差异)为主要鉴定指标，参考发芽率(>50%)、苗高(>4.5 cm，超过或接近于水面顶端)、缺氧反应指数(>0.6)等，筛选出低氧耐性表现较好的材料15份：W-14、W-82、W-91、Z-7、Z-54、Z-55、L-13、L-26、W-69、W-111、Z-19、Z-41、L-2、L-8和L-31(表5)。

图1 供试材料在不同处理条件下成苗率Fig.1 Seedling rate under different seed treatments

表5 15份耐冷性较好材料Table 5 15 materials with better resistance to low temperature

2.3.3低温低氧复合胁迫鉴定

低温低氧复合胁迫下，59份供试材料在12 ℃低温淹水处理10 d后，仅有3份材料的苗高与对照差异不大，其余材料均表现为：低发芽率、芽长生长缓慢，基本无新根发出。在沥水后恢复培养10 d，有39份材料表现出较高出苗率，通过对39份材料对比分析(表6)发现，不同处理对根长的影响较大，正常处理条件下供试材料根长均值为9.75 cm，胁迫处理后其均值为7.79 cm，较对照下降了20.21%；不同处理对根数基本无影响；胁迫处理后苗高、鲜重分别较对照下降4.51%和9.06%。同一处理条件下，尽管不同材料间各性状存在一定差异，在随后的成苗实验中，39份材料均可正常成苗。

表6 混合胁迫下各性状的平均值、最大值、最小值及变异系数Table 6 The average value,maximum value,minimum value and coefficient of variation of characteristics under mixed stress treatment

2.4 覆土鉴定

覆土鉴定结果见表7和图1。从中可见，无论是干籽还是催芽播种，所有供试材料的成苗率均高于50%，表现较高成苗率。浸种催芽播种平均成苗率为66.6%，干籽播种成苗率为65.98%，两种处理间成苗率差异不明显。两种处理方式下成苗率均高于60%的有19份。

2.5 大田鉴定

对219份材料进行自然条件鉴定(后期增加课题组新创制材料23份)。大田条件下出苗率高于80%的有19份，其中成苗率超80%的有7份；出苗率、成苗率低于60%的分别有163份和184份，占供试材料的55.91%和72.44%，就出苗速度看，10 d出苗的材料仅有3份，20 d内出苗的材料有21份，90.41%的供试材料出苗天数超20 d(表8、表9)。供试材料整体出苗、成苗率低、出苗速度慢，可能与播种深度、土壤水分、室内温度变化大等因素有关。

表7 覆土处理后部分材料成苗率Table 7 Seedling rate of partial materials after soil cover treatment

表8 21份田间表现较好材料Table 8 Field performance of 21 materials

表9 自然条件下不同材料的出苗情况Table 9 Seedlings of different materials under natural conditions

3 结果与讨论

对收集到的238份材料经简易程序筛选，初筛到59份耐低温低氧材料。对该批材料进行低温鉴定，综合发芽率、芽长、根长、发芽指数和活力指数等指标，共筛选到较耐冷材料19份，其中，W-14、W-32、W-82、W-91、Z-36、Z-59、L-8、L-45等8份材料表现较强耐低温。以低氧胁迫下胚芽鞘长度为主要鉴定指标，参考发芽率、苗高、缺氧反应指数等，筛选出表现较好低氧耐性材料15份：W-14、W-82、W-91、Z-7、Z-54、Z-55、L-13、L-26、W-69、W-111、Z-59、Z-41、L-2、L-8和L-31。59份供试材料经低温低氧复合胁迫后，有39份材料能快速恢复生长、出苗率较高，并能正常成苗；室内覆土试验显示，在催芽和干籽条件下成苗率高于60%的有19份材料；田间鉴定有21份材料表现出高的出苗成苗率(>60%)且出苗速度相对较快(出苗时间少于20 d)。综合混合胁迫、覆土试验和田间鉴定结果，共获得16份较耐低温低氧材料，分别为：L-2、L-30、L-39、L-5、L-8、W-106、W-14、W-39、W-43、W-65、W-82、W-86、Z-32、Z-33、Z-59和Z-7。室内覆土试验结果与大田自然鉴定试验结果相符。同时，筛选出的材料与室内低温低氧混合胁迫筛选结果也基本一致；大田出苗成苗率较好，出苗速度相对较快的材料，其在室内混合胁迫中表现较好。

本研究中，通过简易程序，以萌发率、发芽率和发芽势为指标，经初步筛选出的材料在后期的精准鉴定试验中均表现出较好的低温低氧耐性、出苗成苗率，这种方式可适用于大批次的种质资源低温低氧耐性筛选。前人多以低温发芽率作为耐冷资源评价指标。本研究结果表明，在耐冷材料的精准鉴定中，加入发芽指数和活力指数等指标，通过观察材料间发芽速度的快慢，可以更为有效地区分耐冷性差异较小材料。在现有的不多耐低氧资源评价研究中，多以低氧胁迫下胚芽鞘的长度作为鉴定指标。本研究发现，低氧胁迫下材料间发芽率存在显著差异，不同材料间幼苗高度差异极大，建议在以后的耐低氧资源评价中，增加低氧胁迫下发芽率和幼苗高度作为参考指标。

低温和低氧是直播水稻萌发期面临的两大主要问题，本研究以出苗成苗率作为关键鉴定指标，对经室内精准鉴定后的材料进行覆土试验、大田试验，结果表明，在田间也表现出较高的出苗成苗率。筛选出的19份耐低温材料中有7份材料在混合胁迫下表现良好，筛选到的15份耐低氧材料中有5份材料在混合胁迫下表现良好。