核桃乳DNA提取方法优化与DNA条形码鉴定

黄灵芝，姜广泽，丁艳菲，朱 诚，*

(1.中国计量大学 生命科学学院，浙江省特色农产品品质及危害物控制技术重点实验室，浙江 杭州 310018； 2.杭州迪安医学检验中心有限公司，浙江 杭州 310030)

近年来我国乳饮料行业迅猛发展，以核桃乳为代表的植物蛋白饮料产量、销量成快速增长态势。核桃乳是采用现代工艺、科学加工而成，不仅口感细腻、营养丰富，还是多种微量元素的良好来源，具有健胃、补血等功效，在我国一直属于畅销产品。然而，核桃乳掺杂使假现象层出不穷，手段和方式五花八门，检测和鉴定困难重重，因过敏源成分不明对消费者的人身健康构成威胁，影响乳饮料产业稳定发展。因此，急需建立一种快捷、准确的真伪鉴定方法。DNA条形码(DNA barcoding)是一种新型的物种鉴定技术，它利用标准的短基因区域作为标记对物种进行快速、准确和高效鉴定。近年来DNA条形码已广泛应用于中草药、水产品与加工食品等多领域的物种鉴定。Stoeckle等构建了茶饮料通用条形码和，并对凉茶进行鉴定。李梅阁利用DNA条形码技术对浆果及其果汁饮料进行了种源物种真伪鉴定。但是目前基于DNA条形码技术的核桃乳饮料真伪鉴定尚缺乏研究。

高质量的核桃乳DNA对开展核桃乳DNA条形码真伪鉴定尤为重要。核桃乳属于深加工食品，繁琐的加工过程使种源物种核桃的DNA严重破坏降解，且富含多种次生物质，DNA提取更加困难。国外至今尚无对核桃乳DNA提取方法的报道，有关乳制品DNA提取方法相关研究集中在牛奶、羊乳上。Psifidi等在基于PCR的绵羊乳基因分型研究中比较分析了6种提取绵羊乳DNA的方法。Usman等通过比较2种改良试剂盒和1种传统试剂提取方法，得到了适合大量牛奶DNA提取的试剂盒方法。郭梁等通过比较3种DNA提取方法，得到适合乳制品DNA提取的试剂盒方法。总结国内外文献关于乳饮料DNA提取方法的研究，将DNA提取方法分为传统试剂CTAB方法、试剂盒方法与改良试剂盒方法。任君安等对果蔬汁饮料DNA提取方法做了研究，通过比对CTAB与植物DNA提取试剂盒方法，得到了改良试剂盒方法。韩晴等在利用植物DNA条形码技术对杏仁露中花生源性成分鉴别的研究中，采用改良深加工食品试剂盒方法，得到具备扩增条件的杏仁露DNA。杨硕等采用植物核酸提取试剂盒得到核桃乳DNA，质量体积分数为10～40 ng·μL，/为1.6～2.2。上述方法提取的DNA浓度偏低，纯度不高，质量不佳。因此，本研究筛选得到核桃乳DNA提取最佳预处理方式，比较不同核桃乳DNA提取方法，筛选出适合核桃乳DNA高质量提取的最佳组合方法。在此基础上，设计针对核桃的特异性基因--，对样本进行核桃乳成分鉴定；并选取常见植物候选DNA条形码基因-，测序比对以完成核桃乳掺假鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

从国内市场购得国内一二线城市在售的10种核桃乳和10种坚果。该10种核桃乳中的核桃含量基本一致，均有蛋白沉淀，但色泽不同。每种样品各取3个生物学重复，且随机排序并编号(1～30)。10种坚果分别为核桃、腰果、巴旦木、夏威夷果、碧根果、榛子、杏仁、大豆、花生、松子。样品置于4 ℃保存。

十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、乙二胺四乙酸(EDTA)、Tris-HCl、氯化钠(NaCl)、异丙醇、Tris饱和酚、氯仿购于杭州米克化工仪器有限公司；康为新型植物基因组DNA提取试剂盒(简称康为试剂盒)购于北京康为世纪生物科技有限公司，爱思进植物基因组DNA提取试剂盒(简称爱思进试剂盒)购于爱思进康宁生命科学有限公司，天根深加工食品DNA提取试剂盒(简称天根试剂盒)购于天根生化科技(北京)有限公司；核酸染料goldview购于北京庄盟国际生物基因科技有限公司，低电渗琼脂糖购于生工生物工程(上海)股份有限公司；普通PCR试剂盒ExPrimix和DNA marker购于宝生物工程(大连)有限公司。引物与测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 仪器与设备

快速PCR仪，AnalytikJenaAG德国耶拿；电泳仪与凝胶成像系统，上海天能，EPS300，5200Multi；冷冻离心机，美国BeckmanCoulter，Microfuge20R；真空冻干仪，美国LABCONCO FreeZone2.5Plus；微量核酸蛋白测定仪，杭州奥盛仪器，Nanodrop-100。

1.3 方法

1.3.1 核桃乳与坚果DNA提取

预处理方法筛选。方法1(静置抽提)：核桃乳静置30 min，底部吸取0.5 mL沉淀乳直接提取。方法2(异丙醇沉淀)：吸取1 mL核桃乳，加入等体积异丙醇，混合均匀，沉淀10 min，室温12 500×离心5 min，弃上清后重复操作1次，所得沉淀进行DNA提取。方法3(抽真空冻干)：将核桃乳混匀后分装至一次性培养皿，真空冻干机冷冻48 h，所得干粉进行DNA提取。利用国家食品药品监督管理总局《植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定》中的方法，分别对不同预处理的核桃乳进行DNA提取。

DNA提取方法比较。采用微量提取，每种方法对每个样品进行3次重复实验。对6种DNA提取方法进行比较，分别为2种CTAB裂解沉淀方法、3种试剂盒方法和CTAB与爱思进试剂盒结合方法。其中，2种CTAB裂解沉淀方法依照参考文献和国家标准方法操作，CTAB方法1参照《果蔬汁饮料DNA提取方法比较研究》的方法；CTAB方法2根据国家食品药品监督管理总局《植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定》提供的植物蛋白饮料DNA提取方法。3种试剂盒方法分别为康为试剂盒、爱思进试剂盒和天根试剂盒，操作流程以说明书为准。CTAB与爱思进试剂盒结合方法详细步骤如下：

1)称取真空冻干样品100 mg至研钵中，加液氮轻轻研磨，将研钵放于56 ℃水浴至样品粉末刚开始融化，加入500 μL预热的改良CTAB裂解液(质量分数3% CTAB、0.1 mol·LTris-HCl，pH调控为8.0，0.02 mol·LEDTA，1.4 mol·LNaCl，体积分数0.2%-巯基乙醇，质量分数2%聚乙烯吡咯烷酮)、4 μL RNaseA和10 μL Proteinase K(20 mg·mL)，混合成乳液，转移至灭菌的2 mL Eppordorf管中，加入300 μL Buffer C-L，漩涡振荡30 s。

2)56 ℃水浴孵育2 h，其间每隔5～10 min上下颠倒振荡1次，裂解至越澄清越好。

3) 加入500 μL Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇(体积比25∶24∶1)，混匀，加入500 μL Buffer P-D，轻轻振荡1 min，室温抽提10 min，12 500×离心10 min，离心温度15 ℃。

4)将上层水相转移至新的离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)，充分混匀，静置5 min，12 500×离心8 min。

5)将上清液转移至新的离心管中，加0.8倍体积的异丙醇(4 ℃ 冰箱预冷)，轻轻混合均匀，-20 ℃冰箱静置20 min，12 500×离心10 min，弃上清液，保留沉淀。

6)加入500 μL的70%乙醇，上下颠倒，充分洗涤。12 500×g离心3 min，弃上清，加入500 μL的无水乙醇，上下颠倒，充分洗涤，12 500×g离心3 min。

7)用滤纸吸干多余水分，在超净台吹干或室温晾干。加入50 μL预热洗脱缓冲液TE，静置15 min。测DNA浓度与质量。

坚果DNA提取。坚果经液氮研磨成粉末后取0.1 g，采用CTAB沉淀法提取DNA。

基因组DNA纯度和浓度检测。利用NanoDrop Lite微量核酸蛋白测定仪测定以上不同方法提取的核桃乳DNA，由/和浓度(ng·μL)判定DNA的纯度和浓度；通过琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA片段质量。

1.3.2 PCR扩增与产物测序

采用文献报道植物通用基因-03对不同方法所提核桃乳DNA进行PCR扩增，检测所提DNA是否具备扩增条件。依据常见植物候选DNA条形码基因-，设计核桃物种特异性基因--对10种核桃乳样品DNA进行PCR扩增，对样本进行造假情况鉴定。利用常见植物候选DNA条形码基因-对10种市售核桃乳样品DNA进行PCR扩增，对样本进行掺假情况鉴定。引物序列见表1。

PCR扩增采用25 μL体系：12.5 μL的ExPrimix，正反引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，无菌水10.5 μL。PCR程序为：95 ℃预变性5 min，共35个循环(95 ℃变性30 s、退火30 s、72 ℃延伸30 s)；72 ℃终延伸10 min，最后4 ℃保温。PCR产物经琼脂糖凝胶进行电泳，并由生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST比对，利用DNA条形码分析鉴定核桃乳是否掺假。

2 结果与分析

2.1 核桃乳最佳预处理方法

核桃乳是深加工食品，DNA破坏严重。所得大部分DNA片段小，部分长片段DNA因浓度低，电泳图上无清晰完整条带。3种预处理方法DNA电泳图差异明显(图1)，方法1静置沉淀方式处理后所得DNA只有个别存在DNA小片段，方法2异丙醇离心方式处理所提DNA全部呈现降解弥散状，方法3抽真空冻干方式所提DNA存在明显小片段。由表2可以看出，方法1与方法2的浓度高低不均，/普遍超出DNA标准范围；方法3测定的浓度符合扩增要求且纯度值接近DNA标准值1.80。因此，方法3抽真空冻干预处理方式最适合用于核桃乳DNA提取。

表1 基因引物序列

M，10 000 bp DNA 分子量标准；N，空白对照；方法1，静置沉淀；方法2，异丙醇沉淀；方法3，抽真空冻干；1～30，核桃乳样品编号1～30。M， 10 000 bp DNA marker； N， Negative； Method 1， Static extraction； Method 2， Isopropanol precipitation； Method 3， Vacuum lyophilization； 1-30： Sample serial number 1-30.图1 三种不同预处理方法提取的核桃乳DNA电泳图Fig.1 DNA electrophoresis of walnut milk extracted by three different pre-treatment methods

表2 三种预处理方法提取的核桃乳DNA浓度和纯度

2.2 六种DNA提取方法的比较结果

分别采用CTAB方法1、CTAB方法2、康为试剂盒、爱思进试剂盒、天根试剂盒和CTAB与爱思进试剂盒结合这6种方法，对真空冻干预处理的核桃乳进行DNA提取，并进行琼脂糖凝胶电泳。结果(图2)显示，天根试剂盒方法和CTAB与爱思进试剂盒结合2种方法所提核桃乳DNA质量优于其他方法，尤其是CTAB与爱思进试剂盒结合方法，所提DNA条带明亮且片段长，相对完整性好。表3显示：CTAB与爱思进试剂盒结合方法所得DNA纯度最高，最接近DNA标准值1.80，且浓度高于其他3种试剂盒方法；CTAB方法1虽浓度高，但纯度差。利用植物通用基因-03对6种方法所提核桃乳DNA进行PCR扩增，扩增结果如图3所示。与其他提取方法比较，CTAB与爱思进试剂盒结合方法、天根试剂盒方法提取的核桃乳DNA的扩增效率较高。其中，CTAB与爱思进试剂盒结合方法所提核桃乳DNA在123 bp处有明显条带，条带单一且无引物二聚体，与-03基因片段大小相符，扩增效率为100%，符合DNA条形码后期实验扩增要求。因此，CTAB与爱思进试剂盒结合方法为核桃乳DNA的最佳提取方法。

M，10 000 bp DNA分子量标准；N，空白对照；1，样品编号1-3；2，样品编号4-6；3，样品编号7-9；4，样品编号10-12；5，样品编号13-15；6，样品编号16-18；7，样品编号19-21；8，样品编号22-24；9，样品编号25-27；10，样品编号28-30。M， 10 000 bp DNA marker； N， Negative； 1， Sample serial number 1-3； 2， Sample serial number 4-6； 3， Sample serial number 7-9； 4， Sample serial number 10-12； 5， Sample serial number 13-15； 6， Sample serial number 16-18； 7， Sample serial number 19-21； 8， Sample serial number 22-24； 9， Sample serial number 25-27； 10， Sample serial number 28-30.图2 六种方法提取核桃乳DNA电泳图Fig.2 DNA extraction of walnut milk by six methods

表3 六种方法提取核桃乳DNA浓度与纯度(n=3)

M，500 bp DNA 分子量标准；N，空白对照；编号1-10同图2。图5同。M， 500 bp DNA marker； N， Negative； Numbers 1-10 were the same as in figure 2. The same as figure 5.图3 六种方法提取核桃乳CP-03基因扩增结果Fig.3 Amplication results of CP-03 gene from walnut milk by six methods

2.3 核桃物种特异性基因psbA-trnH-wal鉴定结果

对样本进行核桃乳成分鉴定，设计核桃物种特异性引物Wal-F和Wal-R，对10种不同品牌核桃乳和10种坚果的DNA样品进行PCR扩增，3次生物学重复。结果显示，10种坚果(图4-A)中只在核桃的3组DNA样本(样品编号1-3)中有扩增条带，说明引物特异性良好；10种核桃乳(图4-B)中有29个DNA样品中有扩增条带，第25号样品没有扩增出条带，第26和27号成功扩增出条带，说明该样品含有核桃成分；而第25号样品可能在实验操作上出现了问题，故没有扩增出条带。表明这10种核桃乳均含有核桃成分。

2.4 常见植物候选基因psbA-trnH鉴定和测序比对结果

为了验证核桃乳是否存在掺假行为，以CTAB与爱思进试剂盒结合方法提取的10种品牌30个核桃乳DNA为模板，分别用DNA条形码基因-进行PCR扩增检测，并将产物进行测序。核桃乳DNA均能扩增出单一且清晰、长度为350 bp的目的条带(图5)。将扩增序列在NCBI数据库进行BLAST分析，结果显示，绝大部分核桃乳样品(1-21号、25-30号)测序比对结果为核桃，与标签中的优质核桃仁相符。22-24号品牌标签为优质核桃仁，但是其DNA扩增测序比对结果为花生，比对结果相似度为100%，与标签标注的原材料不一致，存在标签错误标注行为。

M，500 bp DNA分子量标准；N，阴性对照。图A中：1～3，核桃；4～6，腰果；7～9，巴旦木；10～12，夏威夷果；13～15，碧根果；16～18，榛子；19～21，杏仁；22～24，大豆；25～27，花生；28～30，松子。图B中：1-30为核桃乳样品编号，同表2。M， 500 bp DNA marker； N， Negative； In figure A： 1-3， Walnuts； 4-6， Cashews； 7-9， almonds； 10-12， Queensland nuts； 13-15， Pecans； 16-18， Hazelnuts； 19-21， Apricots； 22-24， Soybeans； 25-27， Peanuts； 28-30， Pine nuts. In figure B， 1-30 were sample serial number of walnut milk， and were the same as in Table 2.图4 十种坚果和十种核桃乳样品的特异性引物Wal-F和Wal-R PCR扩增结果Fig.4 PCR amplification results of 10 kinds of nuts and 10 kinds of walnut milk samples using specific primer Wal-F and Wal-R

图5 核桃乳DNA条形码基因psbA-trnH的PCR扩增结果Fig.5 PCR amplification results of DNA barcode gene psbA-trnH of walnut milk

3 讨论

目前食品真伪的鉴定已从传统形态学发展到依赖蛋白质和DNA序列分析的分子生物学方法。在饮料真伪鉴定中应用蛋白质检验的主要方法包括免疫学检测、新型电泳和质谱色谱技术。这些技术虽然在检测新鲜产品时非常有效，但应用于深度加工食品时效率较低。而以DNA为基础的方法可以对残存量非常低的有机原料进行提取和鉴定，目前，该方法已应用于对多种食品材料组合的检测。DNA条形码技术是利用一段或几段标准DNA序列实现动物、植植物和真菌物种快速鉴定的方法，弥补了传统鉴定方法的不足，具有检测范围广、操作简单、准确度高、鉴别效率高、信息化等优点。DNA条形码技术已广泛应用于食品等各个领域的鉴定。Lee等利用DNA条形码技术对茶的品种与来源进行了鉴定。Uncu等利用DNA条形码基因对橄榄油掺假进行了研究，结果表明，利用DNA条形码技术可对植物油中植物源成分进行鉴定。可见国外主要是集中在茶与油产品，而对植物蛋白饮料尚未进行真伪鉴定研究。

表4 psbA-trnH基因扩增序列比对结果

高质量的DNA是进行DNA条形码鉴定研究的基础。目前乳、饮料类食品的DNA提取方法主要分为传统试剂法与商业试剂盒两种方法。商业化的植物DNA提取试剂盒有适用范围广、时间短和操作简单的优点，但不同食品尤其是深加工食品对试剂盒的适用性不同，所提DNA质量存在明显差异。夏义苗等通过对大豆油不同DNA提取方法进行比较分析，总结有益经验，得到大豆油最佳提取方法。不同的加工工艺对食品DNA提取也存在不同程度的影响。深加工食品核桃乳DNA破坏严重，多糖多酚与色素生物碱等次生物质的存在提高了DNA提取难度。多酚能被氧化褐变，与DNA结合形成不可逆复合物，使最终提取的DNA呈褐色现象，降低DNA活性。为了防止酚类褐变，本研究在CTAB裂解液中加入β-巯基乙醇。选择合适浓度的NaCl可以增加多糖在乙醇中的溶解度，避免与DNA产生共沉淀现象，从而除去DNA中的多糖物质。增加乙醇洗涤力度，以求最大程度去除杂质。考虑到试剂盒吸附柱无法存留小片段DNA，采用离心沉淀方法代替吸附柱。本研究从静置抽提、异丙醇沉淀、抽真空冻干3种不同预处理方式中，筛选得到了抽真空冻干方法为核桃乳DNA提取的最佳预处理方式。并选择6种DNA提取方法或试剂盒进行实验，其中，爱思进试剂盒是一种多源植物基因组DNA提取试剂盒，利用特殊的裂解液C-L和沉淀缓冲液P-D，能有效地把蛋白质、色素、碳水化合物和脂质与基因组DNA分开，DNA制备膜会选择性吸附DNA，所提取的DNA杂质少，从而达到基因组DNA纯化目的。但爱思进试剂盒存在裂解能力弱的缺点，而CTAB裂解沉淀方法正好可以弥补此弱点，故在此基础上利用CTAB与爱思进试剂盒结合方法来提取核桃乳的DNA。结果显示，CTAB与爱思进试剂盒结合的新方法能够得到高质量的核桃乳DNA，纯度值在1.7～1.9，浓度在60～140 ng·μL，且扩增效率好，符合DNA条形码对核桃乳目的种源成分真伪鉴定的后续实验要求。

-序列是植物分子系统发育研究中常用且可靠的叶绿体条形码基因，有着较快的进化速率和较高的物种鉴别效率。Sun等利用7个候选DNA条形码对44个金银花及其近源物种进行鉴定，发现-鉴定效率高达100%。本研究利用DNA条形码基因-对10种核桃乳DNA进行PCR扩增测序检测。扩增测序结果显示10种核桃乳样品中有1款核桃乳成分测序比对结果为花生，该样品属于掺假产品。

4 结论

抽真空冻干方法为核桃乳DNA提取的最佳预处理方式，CTAB与爱思进试剂盒结合的方法更适合从核桃乳中提取DNA。利用自行设计的特异性基因--鉴定核桃乳样品中是否含有核桃成分，确定造假情况；选择常见植物候选基因-鉴定核桃乳样品中是否含有其他成分，确定掺假情况。基于-基因的DNA条形码建立的核桃乳掺假造假鉴定方法，可以在植物蛋白饮料的鉴定应用中贡献绵薄之力。