芦笋性别基因型的分子鉴定新技术与超雄株筛选

李乐斌 张景丽 冯 光 舒 骏 林子翔 张建隆 娄建英黄文斌*

（1 温州市神鹿种业有限公司，浙江温州 325014；2 瑞安市神鹿农业科技有限公司，浙江温州 325200）

DNA 分子标记技术广泛应用于作物育种、种子纯度鉴定、品种真实性鉴定等方面，而基因组DNA 提取则是其第一步。植物基因组DNA 的提取方法逐渐由繁入简，一些简便的提取方法得到快速发展，如碱煮法（赵国珍 等，2012；李委 等，2018）、滤纸吸附法（Zou et al.，2017；杨璐 等，2019；王沙沙 等，2020）等。滤纸吸附法是近些年开发的新方法，吸附有DNA 的滤纸片可以直接作为PCR 模板，也可以将其上的DNA 溶出到双蒸水里再用于PCR 扩增。快速获得基因组DNA 有助于分子标记技术的大规模应用，比如在苗期快速鉴别芦笋（L.）的性别。

芦笋是雌雄异株植物，其性别发育受到位于Y 染色体上的非重组性别决定区域影响，其中性别关键基因是（）和（）（Harkess et al.，2017）。在自然环境下有极少数的雄株（基因型XY，雄蕊正常、雌蕊败育）会产生两性花（雄蕊正常、雌蕊正常），能够自花或异花授粉结实，产生XX ♀∶XY ♂∶YY ♂=1∶2∶1的后代，其中YY 雄株（也被称为超雄株）的花粉具有活力，它是芦笋全雄品种选育的关键。然而，YY 雄株与XY 雄株在表型上没有明显差异，通常采用测交法，从测交后代花期的性状来判断父本的基因型（XX × YY → XY，XX × XY → 1XX +1XY），一般需要2～3 年。Y 染色体连锁的分子标记（如MSSTS710、asp1-T7 sp、asp1-T7）的开发使得测交后代在幼苗期就能检测性别（Jamsari et al.，2004；Nakayama et al.，2006；Kanno et al.，2014）。周劲松等（2012）使用雄性显性标记asp1-T7 和asp1-T7 sp 在芦笋幼苗期检测测交后代的性别，从两性株自交后代的14 株雄株中筛选出2 株超雄株。芦笋完成全基因组测序后，周劲松等（2017）以基因为基础开发了4 个相关标记，Mitoma 等（2018）针对基因开发了AspMSD标记。但是这些标记都是Y 连锁显性标记，鲜见共显性标记和X 连锁标记的相关研究报道，且对两性株自交后代里超雄株的筛选仍需进行测交试验。直至Harkess 等（2020）证实了（）基因位于芦笋X 染色体上，且Y 染色体上不具有等位基因。那么通过检测该基因就可能实现XY 雄株和YY 雄株的区分，从而减少筛选年限。

本试验应用改良的滤纸吸附法（滤纸圆盘法）快速提取芦笋基因组DNA 并进行PCR 扩增；通过两步法来区分芦笋两性株自交后代的不同性别基因型：先使用标记aspMSE1-xy 或aspTDF1-y 筛选出雄株（XY 和YY），再使用标记aspWIP2/NTT-x剔除XY 雄株，判定剩余的雄株为YY 型。

1 材料与方法

1.1 供试材料

二倍体绿芦笋XX 雌株、XY 雄株和四倍体紫芦笋XXXX 雌株、XXXY 雄株的拟叶样品采集于温州市神鹿种业有限公司种质资源圃，用于性别连锁标记验证的YY 雄株拟叶样品由杭州浙丰农业科技有限公司提供（表1）。

表1 供试芦笋类型及名称

芦笋两性株自交种子于2020 年8 月采收自温州市神鹿种业芦笋种质资源圃编号为48-2 的两性株，播种后正常发芽生长的有14 株（48-2-01～48-2-14），后定植于育种材料圃。

1.2 试验方法

1.2.1 滤纸圆盘法提取DNA ①滤纸圆盘的制备。滤纸采用Whatman双圈定性慢速滤纸（盐城六品商贸有限公司），使用打孔器制备直径3 mm的滤纸圆盘，用竹牙签稍微插入圆盘中间，整个置于玻璃培养皿，包好、灭菌、烘干，用于吸附核酸。

② DNA 提取。按照Zou 等（2017）的方法并适当改良：取芦笋拟叶样品0.05 g 置于2.0 mL 离心管中，加入2 颗直径3 mm 的不锈钢珠，将离心管放入液氮中速冻10 s，取出后快速用SCIENTZ-48高通量组织研磨器破碎（50 Hz、15 s，宁波新芝生物科技有限公司，下同），之后加入1.0 mL DNA裂解液〔20 mmol·LTris（pH 8.0），25 mmol·LNaCl，2.5 mmol·LEDTA，0.05% SDS〕，涡旋混匀约10 s。将准备好的滤纸圆盘浸入裂解混合物中5 s 吸附核酸，再把圆盘转移到1.0 mL 清洗液〔10 mmol·LTris（pH 8.0），0.1% Tween-20〕中浸泡5 s，以去除表面吸附的杂质，然后将圆盘存留于30μL无菌双蒸水里，即为DNA 溶出液。

1.2.2 试剂盒提取DNA 取芦笋拟叶样品0.05 g，用组织研磨器破碎后，按照试剂盒〔DP350，天根生化科技（北京）有限公司〕操作说明书提取DNA，最后用150 μL 无菌双蒸水洗脱。将该DNA溶液稀释10 倍作为PCR 模板使用。用于性别连锁标记验证的芦笋DNA 均使用试剂盒提取。

1.2.3 PCR 扩增及电泳检测 标记asp1-T7sp 的引物依照Nakayama 等（2006）的方法合成；标记aspMSE1-xy、aspTDF1-y 和aspWIP2/NTT-x 的 引物分别根据其基因序列使用Primer Premier 5 设计（表2）。25 μL PCR 反应体系：2×PCR Master Mix Ⅱ 12.5 μL〔KT211，天根生化科技（北京）有限公司〕，上下游引物（5 μmol·L）各1.0 μL，模板〔DNA 溶出液1.0 μL（或3.0 μL）或吸附有DNA 的滤纸圆盘〕，灭菌双蒸水补足至25 μL。PCR 程序均为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，30 个（或35 个）循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后取扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，凝胶成像系统拍照保存。

表2 PCR 扩增引物

2 结果与分析

2.1 滤纸圆盘法快速提取芦笋基因组DNA

芦笋拟叶基因组DNA 可以使用滤纸圆盘法提取，但DNA 浓度较低（图1）。吸附有DNA 的滤纸圆盘可以直接作为PCR 模板，也可以使用其溶出液作为PCR 模板（图2-A）。使用溶出液作为模板时，低浓度的DNA 模板会影响PCR 特异DNA片段的浓度（以条带的相对亮度体现），但不影响PCR 的结果（表现阳性或阴性）。芦笋拟叶裂解液在4 ℃存放14 d 后仍能作为模板扩增出目的片段（图2-B）。因此，滤纸圆盘法提取的DNA 可以用于特异DNA 片段的PCR 扩增，便于快捷鉴定芦笋性别基因型。

图1 试剂盒和滤纸圆盘法提取的芦笋DNA

图2 滤纸圆盘及其溶出液的芦笋标记asp1-T7sp PCR 扩增结果

2.2 芦笋性别连锁标记的验证

随着芦笋性染色体研究的深入，新的标记逐渐得到开发应用。芦笋基因、和的研究结果显示其均与性别相关（Murase et al.，2017；Harkess et al.，2017，2020），可以根据它们的基因序列设计引物用于芦笋性别的鉴定。标记aspMSE1-xy 在雄株上有472 bp 和261 bp 两条特异DNA 片段，在雌株上只有1 条261 bp 特异DNA 片段；并且，无论雌雄株，该标记在约1 000 bp 处有1 条亮度较浅的DNA 片段，且亮度随着DNA 模板浓度的增大而增强，但其不影响雌雄株的区分。标记aspTDF1-y 在雄株上有1 条472 bp特异DNA 片段，雌株则没有该特异DNA 片段。标记aspWIP2/NTT-x 在XY 雄株和雌株上有1 条346 bp 特异DNA 片段，而超雄株没有该特异DNA片段（表2）。这3 个标记在二倍体绿芦笋和四倍体紫芦笋上均呈现相同的特异性DNA 片段（图3、4）。通过组合使用aspMSE1-xy、aspTDF1-y 和aspWIP2/NTT-x 能够区分芦笋性别基因型XX、XY、YY。

图3 标记aspMSE1-xy、aspTDF1-y 和aspWIP2/NTT-x 在绿芦笋上的PCR 扩增结果

图4 标记aspMSE1-xy、aspTDF1-y 和aspWIP2/NTT-x 在紫芦笋上的PCR 扩增结果

2.3 两性株自交后代性别鉴定

14 株两性株48-2 自交后代用滤纸圆盘法提取DNA，以溶出液（溶出时间为2 h）作为PCR 模板，使用标记aspMSE1-xy、aspTDF1-y 和aspWIP2/NTT-x 进行PCR 扩增。PCR 结果显示（图5）：超雄株（YY）有4 株，普通雄株（XY）有7 株，雌株（XX）有3 株。两性株的性别基因型是XY，自交后代应呈YY∶XY∶XX=1∶2∶1 分离；经检验，YY∶XY∶XX=4∶7∶3，符合1∶2∶1分离比。田间花器官调查结果显示后代48-2-06、48-2-08 和48-2-09 开雌花，其余11 株开雄花，与PCR 结果相符。说明标记aspMSE1-xy、aspTDF1-y 和aspWIP2/NTT-x 联用可以鉴别芦笋两性株自交后代性别基因型。

图5 48-2 两性株自交后代PCR 扩增结果

3 讨论与结论

本试验验证了滤纸圆盘法提取的芦笋DNA 可用于PCR 反应，且用该方法提取了两性株48-2自交后代幼苗的DNA 作为模板，组合使用芦笋性染色体连锁标记aspMSE1-xy、aspTDF1-y 和aspWIP2/NTT-x 来鉴别芦笋性别基因型，成功从中筛选出了超雄株。

DNA 滤纸吸附法大多使用44 mm × 2 mm 滤纸条，滤纸条被分成40 mm × 2 mm 疏水手柄区（使用石蜡浸渍）和4 mm × 2 mm 核酸结合区。本试验中，用竹牙签代替疏水手柄区，简化了操作，且灭菌烘干后可长期存放和随时使用。尽管滤纸圆盘吸附的DNA 较少，但不影响其应用于特异性PCR，且其溶出液可用于多次PCR 反应。其作为一种快速提取DNA 的方法，适用于现场快检领域，通常直接使用滤纸圆盘或者短时溶出液作为快速PCR的检测模板。在操作过程中发现使用滤纸圆盘直接作为PCR 模板时，不能使用液体石蜡来封闭PCR混合液而要使用带盖的PCR 管或者使用热盖，因为滤纸圆盘会吸附液体石蜡、破坏封闭效果使得PCR 混合液蒸发。此外，也会出现滤纸圆盘吸附的DNA 量太少而PCR 结果呈阴性的现象。高浓度的DNA 溶液可以通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA 提取效果，低浓度的DNA 溶液通常使用看家基因标记验证提取效果。标记aspMSE1-xy 在芦笋雌雄株上均有特异DNA 片段，类似于芦笋看家基因标记，可用于验证DNA 提取效果，同时又可区分芦笋性别。

标记aspMSE1-xy 利用了X 染色体上基因（）的第3 个外显子相对于Y 染色体上基因（）发生211 bp 的缺失突变，使得XX 雌株具有261 bp 的PCR 产物，XY 雄株具有261 bp 和472 bp 的PCR 产物，但是本试验ZF01、ZF02 超雄株和两性株48-2 后代YY 超雄株的PCR产物仍为261 bp 和472 bp，这与预想的结果不符（预想结果为YY 雄株只具有472 bp 的PCR 产物，通过该标记能够同时区分XX、XY、YY 基因型）。被认为是拟南芥的同源基因，即芦笋的基因。本试验PCR 产物测序结果和数据分析发现，标记aspMSE1-xy 和aspTDF1-y检测的是同一基因（标记aspMSE1-xy 472 bp 的PCR 产物序列与标记aspTDF1-y 的PCR 产物序列在NCBI 里进行Blast 比对后均指向芦笋同一个基因，且两者的PCR 产物序列比对后有340 bp 序列完全一致）。芦笋的基因（）位于Y 染色体的非重组性别决定区域，而发生了3 次插入突变使得其全长至少在30 kb 以上（仅为2.5 kb），且在第2 个内含子内发生了大片段插入突变（Murase et al.，2017），这可能导致其第3 个外显子被挤出与Y 染色体非重组性别决定区域相对应的区域，进而与Y 染色体的可重组区域发生了重组，使得标记aspMSE1-xy 在ZF01、ZF02 超雄株和两性株48-2 后代YY 超雄株的PCR 产物中同时具有261 bp 和472 bp 两条特异性片段，而261 bp DNA 片段在Y 染色体中的具体位置则需进一步研究确认。已有的研究显示标记asp1-T7 和asp1-T7sp 位于基因周围（盛文 涛，2020），标 记aspMSE1-xy、aspTDF1-y 和AspMSD 则是基于基因开发的，在实际应用中这两组标记相互配合使用，能够更准确地区分芦笋的性别。

芦笋Y 染色体上非重组性别决定区域被预测有13 个候选基因，其中有12 个基因在XX 雌性中缺失（周劲松 等，2017），这可能是Y 连锁显性标记研究发展较快的原因之一。然而，芦笋X 染色体连锁的标记开发进展缓慢，Gebler 等（2007）筛选到了一个与雌性连锁的RAPD 标记，卢龙斗等（2006）也鉴定到1 条雌性多态性扩增片段并转化成了SCAR 标记，但是这些标记通用性差，在育种实践中难以利用。基因是当前唯一能被确认是芦笋X 染色体专有的基因，以此开发的标记aspWIP2/NTT-x 能够区分出XY 雄株和YY雄株。本试验中筛选出的YY 雄株也在进行测交试验，以便进一步验证标记aspWIP2/NTT-x的可靠性。

芦笋YY 雄株的获得除了两性株自交外，还可以通过花药培养的方式获得。XY 雄株的花药可经诱导生成胚状体，继而发育成芽；这些胚状体或芽包含由性细胞发育而成的配子体（单倍体，Y 型或X 型）和由花药体细胞发育而成的孢子体（二倍体，XY 型）。尽管使用染色体计数、流式细胞术等方法可以区分出配子体和孢子体，但是配子体内的Y型单倍体植株和X 型单倍体植株仍需等到花期才能分辨出来。X 染色体连锁标记和Y 染色体连锁标记的组合使用在胚状体或芽期就能区分Y、X 基因型，再对筛选出的Y 型培养物进行流式细胞术检测或染色体计数以确定其为雄性单倍体，这将极大地提高花药培养效率。