赏食兼用百合京鹤高效组培再生体系的优化

祁先宇 张文亮 杨盼盼 徐雷锋* 明 军*

（1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2 沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁沈阳 110866）

百合（spp.）是具有较高营养价值的高档蔬菜，也是观赏花卉，还是我国重要的药用植物（龙雅宜和张金政，1998）。京鹤是中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育的具有自主产权的赏食兼用型优质百合品种，不仅抗逆性较强，而且鳞茎营养成分和生物活性物质含量也较高，具有很高的经济价值，亟须进行大规模繁殖示范推广（袁素霞 等，2016）。

分球繁殖和鳞片扦插是百合生产上常用的繁殖方式，但是这些繁殖方式繁殖系数低，且易积累病毒，影响百合的产量和品质（马生军 等，2018）。植物组织培养是一种可以保障作物品种优良特性的高效、现代化、工厂化原种生产方法。在百合组织培养中，鳞茎不定芽的分化培养是提高百合组培苗繁殖系数的关键步骤。常规的不定芽诱导分化是依据百合品种差异选用不同的细胞分裂素与生长素，不定芽诱导率较低，介于2.00%～4.88%之间（苏菁华，2014；Islam et al.，2017；Sharifi et al.，2017；陈姝男，2018；张旭红 等，2018；Gao et al.，2018；Mohebodini et al.，2018；Sahoo et al.，2018；李茂娟 等，2019；李卓忆，2019；张文婷 等，2019；Royandazagh，2019；符勇耀 等，2020；Patil et al.，2021；Yang et al.，2021）。

草甘膦作为目前使用最广泛、安全的除草剂之一（Krimsky，2022），虽然其作用机制的研究已经比较清楚（Amrhein et al.，1980；Stephen，2019），但是目前未见草甘膦在百合及其他植物组织培养再生方面的研究报道。中国农业科学院蔬菜花卉所百合课题组前期在抗草甘膦转基因京鹤百合的试验研究中，发现低浓度草甘膦对京鹤鳞片不定芽诱导具有显著的促进作用，且诱导率显著高于常规组织培养再生分化体系；本课题组虽然建立了常规的京鹤不定芽诱导体系，但诱导系数（4.32）、生根系数（14.78）仍不高，且没有进行鳞茎增殖方面的试验。因此，本试验首次使用草甘膦为诱导分化剂，以鳞片为外植体，优化京鹤高效组培再生体系，以期为百合鳞片不定芽诱导、组培苗生产提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2018 年4 月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所进行。供试百合品种京鹤为中国农业科学院蔬菜花卉研究所自主培育，所选材料为秋季采收的生长健壮、无病虫害的种球中层鳞片，种球直径10～15 cm。试验用草甘膦（Glyphosate）含量为95%（德国，Sigma，P9556-5G）。

1.2 试验方法

采用MS 固体培养基〔MS 基本培养基（含维生素），琼脂7 g·L，pH 值5.8〕，于121 ℃条件下灭菌20 min。培养室温度为（25 ± 1）℃，暗培养。

1.2.1 草甘膦诱导京鹤鳞片不定芽试验 以本课题组已有的京鹤不定芽分化培养基（MS+1.0 mg·L6-BA+0.1 mg·LNAA+30 g·L蔗糖）为基础，设置4 个草甘膦浓度处理：CK1，0 mg·L；T1，2.5 mg·L；T2，5.0 mg·L；T3，7.5 mg·L。取京鹤健康种球鳞片，洗净后用10%次氯酸钠溶液浸泡灭菌15 min，再用无菌蒸馏水清洗3 遍，然后用解剖刀切割成1 cm × 1 cm 的小方块，接种于添加不同浓度草甘膦的分化培养基上。每处理3 次生物学重复，每重复接种30 个外植体；置于室温25℃条件下进行暗培养，40 d 后统计不定芽数，计算不定芽诱导系数。

不定芽诱导系数=不定芽数/接种的外植体数

1.2.2 6-BA、NAA 对京鹤不定芽增殖的影响 鳞片接种培养40 d 后，将上一试验最佳条件下诱导产生的不定芽转接到添加不同浓度6-BA 与NAA的培养基中进行增殖培养（MS+30 g·L蔗糖）。设置6 个6-BA 与NAA 浓度处理组合：J1，0.5 mg ·L6-BA+0.1 mg·LNAA；J2，0.5 mg·L6-BA+0.2 mg·LNAA；J3，1.0 mg·L6-BA+0.1 mg·LNAA；J4，1.0 mg·L6-BA+0.2 mg·LNAA；J5，2.0 mg·L6-BA+0.1 mg·LNAA；J6，2.0 mg·L6-BA+0.2 mg·LNAA。每处理3次生物学重复，每重复接种30 个外植体；置于室温25 ℃、暗培养条件下进行增殖培养，60 d 后统计再生成的小鳞茎数，计算不定芽增殖系数。

增殖系数=再生小鳞茎数/接种外植体数

1.2.3 蔗糖对京鹤不定芽鳞茎膨大的影响 在MS培养基的基础上，设置4 个蔗糖浓度处理：Z1，30 g·L；Z2，60 g·L；Z3，90 g·L；Z4，120 g ·L。将上一试验最佳条件下得到的直径1 cm 左右的小鳞茎转接至不同蔗糖浓度的培养基中，每处理3 次生物学重复，每重复接种30 个小鳞茎；置于室温25 ℃、暗培养条件下进行鳞茎膨大培养，30 d 后转接1 次，60 d 后统计各鳞茎的直径。

1.2.4 NAA 对京鹤膨大鳞茎生根的影响 在1/2MS+30 g·L蔗糖培养基的基础上，设置4 个NAA 浓度处理：CK2，0 mg·L；G1，0.1 mg·L；G2，0.2 mg·L；G3，0.3 mg·L。将最佳条件下膨大培养60 d 后的鳞茎接种到添加不同浓度NAA的生根培养基中，每处理3 次生物学重复，每重复接种30 个膨大鳞茎；置于室温25 ℃条件下进行暗培养，30 d 后统计所有鳞茎的总根数，计算生根系数。

生根系数=总根数/接种的鳞茎数

1.3 数据处理

利用Microsoft Excel 软件进行试验数据分析，使用SPSS Statistics 17.0 软件进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 草甘膦对京鹤鳞片不定芽诱导分化的效果

不同浓度的草甘膦对京鹤鳞片不定芽的诱导分化有显著影响，鳞片内侧密集分化产生了大量小仔球，而常规的不定芽分化培养基处理（CK1）只是在伤口处形成小仔球（图1）。

图1 草甘膦对京鹤单个鳞片不定芽的诱导分化

从表1 可以看出，T1 处理的诱导系数最高，为6.46，显著高于其他处理；其次是CK1 和T2 处理，T3 处理最低。据观察，T2 和T3 处理的部分外植体有褐化死亡的情况，尤其是T3 处理，褐化死亡率较高（图2）。由此可见，低浓度草甘膦对京鹤不定芽分化具有显著的促进作用，随着浓度升高，不定芽诱导受到阻碍，甚至出现褐化死亡现象。因此，本试验条件下2.5 mg·L草甘膦最有利于京鹤鳞片诱导不定芽。

图2 不同浓度草甘膦对京鹤鳞片不定芽的诱导情况

表1 不同浓度草甘膦诱导分化京鹤鳞片不定芽的效果

2.2 6-BA 和NAA 对京鹤不定芽的增殖效果

从表2 可以看出，不同浓度的6-BA 和NAA对京鹤不定芽增殖系数无显著影响，表明京鹤在不定芽增殖期对6-BA 和NAA 不敏感（图3）。J1 处理不定芽增殖系数最大，6-BA 与NAA 用量较低，定为本次试验京鹤鳞片不定芽增殖的最适组合。

表2 不同浓度6-BA 和NAA 对京鹤不定芽增殖的影响

图3 不同浓度6-BA 和NAA 对京鹤不定芽增殖的影响

2.3 蔗糖对京鹤不定芽鳞茎膨大的影响

从表3 可以看出，在蔗糖浓度为30～90 mg·L时，京鹤不定芽鳞茎直径随着蔗糖浓度的提高而增大；当蔗糖浓度为90 mg·L时，平均鳞茎直径达2.64 cm；而当蔗糖浓度为120 mg·L时，鳞茎直径不升反降。以上说明，本试验条件下90 mg·L蔗糖最有利于京鹤不定芽鳞茎的膨大生长。

表3 不同浓度蔗糖对京鹤不定芽鳞茎膨大的影响

2.4 NAA 对京鹤膨大鳞茎生根的影响

从表4 可以看出，G2 和G3 处理的京鹤膨大鳞茎（组培苗）生根系数显著高于CK2 和G1 处理，其中G3 处理的根也比其他处理更粗壮（图4）。考虑到组培苗后期移栽种植时，健康、粗壮的根是必要的条件，所以本试验选择0.3 mg·LNAA 作为京鹤组培苗生根阶段最合适的浓度。

表4 不同浓度NAA 对京鹤膨大鳞茎生根的影响

图4 不同浓度NAA 对京鹤膨大鳞茎生根的影响

3 讨论与结论

3.1 草甘膦在京鹤鳞片不定芽分化中的作用

前人已经建立了多种百合的组织培养再生体系，如金黄花滇百合（张文婷 等，2019）、欧洲百合（张旭红 等，2018）、兰州百合（Yang et al.，2021）、毛百合（张艳波，2013）、亚洲百合（杨薇红 等，2004）、Caesars Palace（李茂娟 等，2019）、东方百合Starfighter（Youssef et al.，2019）、白花百合（Royandazagh，2019；Patil et al.，2021）等，并且在百合不定芽诱导研究中一般使用细胞分裂素与生长素。

本试验在进行百合鳞片不定芽诱导、分化时，在常规培养组分6-BA、NAA 与蔗糖基础上，首次使用草甘膦作为诱导分化剂。结果表明，低浓度（2.5 mg·L）草甘膦对京鹤不定芽的诱导分化效果显著高于常规诱导培养基，每个外植体都能分化不定芽，诱导系数达到6.46，显著优于前人的试验结果（杨薇红 等，2004；张艳波，2013；苏菁华，2014；Bakhshaie et al.，2016；马生军等，2018；Mohebodini et al.，2018；张文婷 等，2019；符勇耀等，2020；Patil et al.，2021）；并且，本试验中使用不同浓度6-BA、NAA 与30 g·L蔗糖的常规诱导结果，也比有些使用细胞分裂素或生长素组合与不同浓度蔗糖的试验诱导系数高（Sahoo et al.，2018；Lestari et al.，2019；Youssef et al.，2019；Deswiniyanti &Lestari，2020；Filippova et al.，2020）。

3.2 草甘膦在百合鳞片分化中的可能机制及应用

已有研究表明，植物体内存在一种重要的合成芳香族氨基酸的莽草酸途径，在莽草酸途径中，磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）与莽草酸-3-磷酸（S3P）生成5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸，这步反应需要5-稀醇丙酮莽草酸-3-磷酸酯合成酶（EPSPS）的催化，才能进行之后的反应并最终形成苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸（Amrhein et al.，1980）。草甘膦可以通过与磷酸烯醇式丙酮酸结合并形成5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，竞争性的抑制EPSPS，阻断苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的合成来达到杀死杂草的效果（Jaworski，1972；Stephen，2019）。天然植物生长素活性成分IAA 的合成分为依赖色氨酸和非依赖色氨酸两条途径，依赖色氨酸的合成途径又分为吲哚乙醛肟途径、吲哚丙酮酸途径、色胺途径和吲哚乙酰胺途径，在这些依赖色氨酸的途径中，色氨酸作为合成IAA 的重要前体物质，经过一系列酶的催化合成吲哚-3-乙醛肟、色胺、吲哚-3-丙酮酸等中间产物，并最终合成IAA，色氨酸的缺失会影响植物体内生长素的合成（王家利 等，2012）。本试验中，草甘膦的加入可能阻断了京鹤百合鳞片内部色氨酸的合成，进而使生长素合成受阻，导致内源细胞分裂素和生长素的比值升高，促进了鳞片不定芽的分化，其相关作用机制尚需进一步试验探究。

草甘膦常用于转基因材料的抗性筛选，暂时未发现安全问题。草甘膦是否也可以促进其他百合品种不定芽的分化有待进一步研究。

综上，本试验建立了草甘膦诱导京鹤鳞片不定芽分化的高效方法，获得最佳诱导培养基（MS+1.0 mg·L6-BA+0.1 mg·LNAA+2.5 mg·L草甘膦+30 g·L蔗糖），诱导系数达到6.46，显著高于常规培养基；并以此为基础，获得了最佳继代增殖培养基（MS+0.5 mg·L6-BA+0.1 mg·LNAA+30 g·L蔗糖）、鳞茎膨大培养基（MS+90 g·L蔗糖）以及生根培养基（1/2MS +0.3 mg·LNAA+30 g·L蔗糖），建立了优良百合品种京鹤的高效再生体系，为百合鳞片不定芽诱导、组培苗生产提供了新的思路。