甘蓝黑腐病田间病害分级标准的建立与抗源筛选

陈 果 孔枞枞 马洪雪 邓四平 季家磊， 王 勇， 庄 木， 张扬勇， 杨丽梅， 关慧明 方智远， 吕红豪，*

（1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，农业农村部园艺作物生物学与种质创制重点实验室，北京 100081；2 湖南农业大学园艺学院，园艺作物种质创新与新品种选育教育部工程研究中心，蔬菜生物学湖南省重点实验室，湖南长沙 410128；3 乌兰察布冷凉蔬菜院士工作站，内蒙古乌兰察布 012000）

结球甘蓝（L.var.L.）简称甘蓝，是一种重要的芸薹属蔬菜作物，在我国各地广泛种植（方智远，2008）。由野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（pv.，）引起的黑腐病属于细菌性病害，是目前危害甘蓝及其他芸薹属蔬菜生产的主要病害之一。

甘蓝黑腐病最早发生于美国（Garman，1892），随后逐渐蔓延至世界各地，尤其是对亚洲、欧洲和北美的甘蓝类作物生产造成了重大危害（Williams，1980；Jensen et al.，2010；Singh et al.，2016）。我国黑腐病最早发生于20 世纪50 年代末的华北地区（樊护民，1989），80 年代普遍流行于全国各地。近年来，由于不合理的耕作方式以及频发的极端天气等因素，黑腐病对我国芸薹属蔬菜作物的危害逐渐加重，严重时可减产70%以上（张扬 等，2011）。在黑腐病防治方面，传统的农业、化学方法耗时、耗力且效果有限，目前最理想的减轻黑腐病发生的方法是培育和应用抗病品种。

挖掘和筛选抗源材料是开展抗黑腐病育种工作的基础。自20 世纪50 年代以来，国内外学者不断开展甘蓝抗源筛选工作。例如，Bain（1952）采用种子浸染法筛选出2 个抗黑腐病甘蓝品种Early Fuji和Hugenot；刘佳等（1988）采用剪叶法筛选出2份高抗黑腐病的甘蓝材料8286-1 和20-2-5-2；简元才和钉贯靖久（1994）采用离体剪叶法筛选出3份对黑腐病表现出一定抗性的甘蓝材料91-306、91-304 和91-316；Griesbach 等（2003）采用黑腐病生理小种混合接种法筛选出高抗黑腐病甘蓝材料AU4518；张恩慧等（2005）对815 份甘蓝自交系进行抗性鉴定，获得4 份抗黑腐病、兼抗芜菁花叶病毒病和黄瓜花叶病毒病的材料；Lema 等（2012）对256 份甘蓝类蔬菜材料进行黑腐病抗性鉴定，发现甘蓝材料Balón、Quintal de Alsacia 和芥蓝材料MBG-BRS0070 表现出一定的抗性；张云霞（2014）采用室内苗期人工接种的方法筛选出对黑腐病具有稳定抗性的甘蓝材料C7；孔枞枞等（2018）鉴定了99 份甘蓝材料的黑腐病抗性，筛选出2 份高抗材料99-192 和20-2-5。以上研究结果表明，国内外育种工作者在甘蓝黑腐病抗源筛选上取得了一定进展，但甘蓝类蔬菜黑腐病抗源依然匮乏，限制了抗病育种工作的开展。

为了更好地推进抗黑腐病甘蓝育种工作，一方面需要不断挖掘和筛选抗黑腐病种质资源，另一方面需建立与抗病育种工作配套的高效、准确的鉴定方法及评价标准。目前，国内尚无统一的田间黑腐病抗性分级标准，因此，梳理和建立一套关于评价甘蓝黑腐病田间发病情况及抗性水平的标准尤为重要。

本试验通过对种植在内蒙古乌兰察布市的55份甘蓝材料进行田间黑腐病鉴定和筛选，建立了一套结球期甘蓝田间黑腐病病害分级标准；同时对部分甘蓝材料进行室内苗期人工接种抗病性鉴定，验证拟定的黑腐病田间病害分级标准，旨在为甘蓝抗黑腐病育种工作的开展提供抗性种质资源，进而为抗黑腐病甘蓝品种的选育以及芸薹属蔬菜黑腐病的科学合理防治提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试55 份甘蓝种质均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所甘蓝青花菜课题组提供，包括26 份自交系（自交6 代以上的纯合材料）、19 份杂交组合和10 份商品种（表1）；其中，抗病对照为自交系21-3，感病对照为自交系BJ（孔枞枞，2019）。室内苗期人工接种抗病性鉴定使用的黑腐病菌菌株由英国华威大学Joana Vicente 教授提供，菌株编号HRIW3811，属于主流1 号生理小种，保存于完全培养基（complete medium，CM）中；培养基配方为：酵母提取物6 g·L，酶水解酪蛋白3 g·L，酸水解酪蛋白3 g·L，蔗糖10 g·L，琼脂15 g·L。

表1 参试55 份甘蓝材料的来源及品种特征特性

续表

1.2 试验方法

1.2.1 甘蓝黑腐病田间抗性鉴定 所有参试材料均种植于内蒙古乌兰察布市集宁区冷凉蔬菜院士工作站试验基地，2020 年和2021 年5 月播种育苗，待幼苗长至5～6 片叶时移入黑腐病病圃田，8 月对结球期甘蓝进行田间发病情况调查。调查内容包括发病甘蓝外叶上病斑的大小、数量、深度、宽度、坏死程度以及是否蔓延至球叶，综合评估发病情况。每份材料3 次重复，每重复10 株，病情指数取两年调查结果的平均值。

1.2.2 甘蓝黑腐病室内苗期人工接种抗病性鉴定 2021 年9 月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所南区试验基地温室内进行，采用苗期喷雾法对23份甘蓝材料（包括13 份自交系、8 份杂交组合和2份商品种）进行接种，病情分级标准和抗性水平的划分参考孔枞枞等（2018）的方法；另外，有5 份自交系的人工接种鉴定结果采用孔枞枞等（2018）和Kong 等（2021）的鉴定结果。

育苗、接种过程：将参试甘蓝材料种子播于21 孔穴盘（62 mm × 62 mm × 65 mm）中，每份材料播种1 盘，每孔播种1 粒；温室内常规育苗，幼苗4～6 片真叶时，选择生长健壮、长势一致的幼苗进行接种。先将黑腐病菌菌株HRIW3811 转接至液体CM 培养基，在28 ℃、200 r·min的条件下过夜培养至菌株对数生长期；用无菌水调节菌液浓度至1 × 10CFU·mL（OD=0.2）。接种前1 d甘蓝幼苗充分浇水并覆膜低温保湿24 h（温度低于15 ℃，湿度大于70%）；接种当天早上使用喷雾器将菌液均匀喷洒到全部叶片上，以叶片无液滴滴落为度，接种后温度升至25 ℃并持续覆膜保湿24 h；然后去除薄膜，于25 ℃条件下常规管理，12～14 d 后调查黑腐病发病情况，计算病情指数。

病情指数（DI）=Σ（各级病株数×该病级值）/（调查总株数×最高级值）× 100

1.3 数据处理

试验数据采用Microsoft Off ice 2019 软件进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 甘蓝结球期黑腐病田间发病症状

黑腐病主要危害甘蓝叶片，幼苗和成株期均可发病。在甘蓝结球期，黑腐病菌主要从外叶叶缘侵入，首先造成叶缘多处泛黄，形成黄色或黄褐色大斑；之后病菌进一步沿维管束扩展到叶柄，形成较大的“V”字形坏死区并造成叶片干腐或脱落（图1）；严重时可造成球叶干枯坏死，甚至整株萎蔫、死亡。黑腐病发生的严重程度与环境湿度关联很大，靠近潮湿地面或者略有积水地方的外叶发病较严重，而中、上层外叶几乎没有或者仅有较少病斑。

图1 甘蓝黑腐病田间发病症状

2.2 甘蓝结球期黑腐病田间病害分级标准的制定

依据甘蓝结球期黑腐病田间发病情况制定0、1、3、5、7、9 级病情分级标准，具体要求见表2和图2。

图2 甘蓝结球期黑腐病田间病情分级标准

表2 甘蓝结球期黑腐病田间病情分级标准

随后基于田间调查结果计算甘蓝结球期黑腐病病情指数（DI），进而划分材料抗性水平：免疫（I），DI=0；高抗（HR），0 ＜DI ≤ 10；抗病（R），10 ＜DI ≤ 30；中抗（MR），30 ＜DI ≤ 50；感病（S），50 ＜DI ≤ 70；高感（HS），DI ＞ 70。

2.3 甘蓝黑腐病田间抗病性鉴定结果

从表3 可以看出，参试26 份甘蓝自交系中，05-574 和20-2-5 表现高抗，病情指数分别为8.52和8.89；MD202 表现抗病，病情指数为16.30；21-3、721、YF 旺旺、多抗福星和HN82 表现中抗，病情指数在38.62～46.03 之间。19 份杂交组合中，05-574 × 207、05-574 × 20-2-5、05-574 × MD202表现抗病，病情指数分别为11.11、24.44、28.15。10 份商品种中，中甘107 和中甘108 表现抗病，病情指数分别为21.48 和25.93。

表3 55 份甘蓝材料黑腐病的田间及室内苗期人工接种抗病性鉴定结果

2.4 甘蓝黑腐病室内苗期人工接种抗病性鉴定结果

室内苗期人工接种抗病性鉴定结果表明（表3），自交系材料中，20-2-5 和05-574 表现高抗（图3），MD202 表现抗病，21-3、721、YF 旺旺、多抗福星和HN82 表现中抗；杂交组合中，05-574 ×MD202 和05-574 × 207 表现抗病，05-574 × 20-2-5表现中抗；商品种中，中甘107 和中甘108 表现中抗。本次试验中抗病对照21-3 的病情指数为30.33，抗性水平为中抗，感病对照BJ 的病情指数为79.60，抗性水平为高感，与孔枞枞（2019）的鉴定结果相符合，说明本次人工接种鉴定结果具有可靠性。

图3 部分甘蓝材料黑腐病田间和室内苗期人工接种抗病性鉴定表现

在本次人工接种鉴定中，大多数材料的抗性水平和田间抗性水平一致，但有6 份材料：自交系似柳生288 和CB521、杂交组合05-574 × 20-2-5 和721 × LY355、商品种中甘107 和中甘108 的抗性水平比田间抗性水平低，推测可能与田间温度、湿度和黑腐病菌田间分布情况等因素有关。

从本试验的总体结果来看，绝大多数材料的室内苗期人工接种抗病性鉴定结果与田间抗性鉴定结果一致，说明此次甘蓝黑腐病田间抗性调查准确度较高，所制定的分级标准可用来反映甘蓝结球期黑腐病田间发病状况。

3 结论与讨论

黑腐病是严重危害十字花科芸薹属作物的细菌性病害之一，由于抗源材料的缺乏，对甘蓝类蔬菜作物的危害尤为严重。目前，国内外报道了极少数高抗黑腐病的甘蓝材料，但大多由于材料抗性不稳定或者遗传机制复杂而未能在育种研究中广泛利用。

为了筛选甘蓝黑腐病抗源材料和制定一套甘蓝黑腐病田间病害分级标准，本试验对种植在内蒙古乌兰察布市的55 份甘蓝材料进行田间抗病性调查，制定出一套适用于田间黑腐病抗性鉴定的分级标准，同时筛选出2 份高抗黑腐病的甘蓝自交系材料05-574 和20-2-5。采用喷雾法对23 份甘蓝材料进行室内苗期人工接种抗病性鉴定，验证了该标准的可靠性。

本试验中，选用了世界范围内的黑腐病主流1号小种作为接种菌株来筛选材料，筛选出的甘蓝材料抗病性强，应用范围广泛。在对55 份甘蓝材料进行黑腐病田间抗病性调查时发现，材料的总体发病较均匀，材料间重复性整体较好；但同时发现，叶片的发病程度与土壤湿度有关，靠近土壤的叶片发病情况比上部叶片更为严重。甘蓝结球期的田间抗性鉴定结果与室内苗期人工接种抗病性鉴定结果较符合，除个别材料抗性水平有差异外，大多数材料结果一致，说明本试验调查结果及数据的准确度较高。

由于国内尚无统一的甘蓝黑腐病田间病害分级标准，本试验根据乌兰察布地区55 份甘蓝材料的发病整体情况初步制定了结球期甘蓝黑腐病田间病级划分标准，计算结果也相对符合材料发病情况，但是该标准是否适用于国内其他地区，今后还需进一步调查、反复比较和完善分级标准，使该标准适用于大多数地区。

根据本次抗病性鉴定结果可知，表现中抗或者抗病的多为扁球型材料。然而随着我国蔬菜产业的发展，早熟性好、叶质脆嫩、球形较好的圆球型甘蓝品种的市场逐渐增加，因此培育抗病且品质优良的圆球型品种成为我国甘蓝育种的重要目标。本试验中，圆球型甘蓝杂交组合05-574 × 207 的田间抗性水平和室内苗期人工接种鉴定抗性水平均达到抗病，对后续的抗黑腐病甘蓝育种工作具有一定的借鉴意义。