参竹降糖方对糖尿病气阴两虚证大鼠模型血糖、血脂及神经内分泌免疫功能的影响

孟智睿 李丽 邵紫萱 刘佳琪 扈觐玺 高晶 王景霞 孟庆飞 王晓茹 陈梅

在中医理论中,2型糖尿病属于消渴症的范畴[1-2],在中医临床中被分为湿热困脾、血瘀脉络、阴虚热盛、气阴两虚、阴阳两虚等五种证型[3],其中气阴两虚是最常见的证型,常采用益气养阴之法治疗[4]。本文针对糖尿病气阴两虚证候类型,拟研发一款保健食品配方“参竹降糖方”,以辅助高危人群降血糖。辅助降血糖是目前中国保健食品的27个保健功能之一,据初步统计,辅助降血糖的保健食品90%是以中药为原料的复方产品,其安全性比药品高,生物活性比普通食品强。随着健康意识的增强,这类辅助降血糖的保健食品的市场需求越来越大。但是,目前这类中药保健食品只有现代保健功能,没有中医证候分型及相应的中医功效。本研究通过建立气阴两虚型高血糖动物模型,评价其益气养阴降血糖的作用,为开发针对气阴两虚型人群的降血糖的保健食品提供科学的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD雄性大鼠60只,体质量(220±20)g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物许可证号:SCXK(京)2016-0006。大鼠饲养于SPF级屏障环境中,SPF级大鼠维持饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供。特殊高脂饲料(猪油10%、蔗糖15%、蛋黄粉15%、酪蛋白5%、胆固醇1.2%、胆酸钠0.2%、碳酸氢钙0.6%、石粉0.4%、鼠维持饲料52.6%)购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。实验符合北京中医药大学相关伦理学要求,伦理审查编号:BUCM-4-2019110201-4032。

1.2 实验药物

参竹降糖方组成:人参片1.5 g(批号:20190501-1)、桑叶3 g(批号:20190501)、葛根3 g(批号:20190501)、玉竹4 g(批号:20190501)、青钱柳3 g(批号:20190518)、蜂胶粉0.5 g(批号:20190618),除去蜂胶粉以外实验药品均用饮片经过水提浓缩而得,每次配药时再等比例加入蜂胶粉。其中人参片、桑叶、葛根、玉竹均购于河北祁新中药颗粒饮片有限公司;青钱柳购买于河北省保定市安国市祁州药市;蜂胶粉(含70%蜂胶)由河南长葛提供。十味消渴胶囊(天津中新药业集团股份有限公司,规格:0.44 g/粒,批号:09950063)。

1.3 主要试剂

链脲佐菌素(sigmag公司,批号:S0130),环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)试剂盒(优尔生生物科技有限公司,批号:L191114614),环磷酸鸟苷(cyclic guanosinc monophosphate,cGMP)试剂盒(优尔生生物科技有限公司,批号:L191008130),三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine,T3)试剂盒(优尔生生物科技有限公司,L191114551),甲状腺素(Thyroxine,T4)试剂盒(优尔生生物科技有限公司,L191104072),空腹胰岛素(fasting insulin,FINS)试剂盒(优尔生生物科技有限公司,批号:L191102001),高密度脂蛋白(highdensity lipoprotein,HDL)试剂盒(长春汇力生物技术有限公司,批号:2019007),低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein,LDL)试剂盒(长春汇力生物技术有限公司,批号:2019011),血清胆固醇(total cholesterol,TC)试剂盒(长春汇力生物技术有限公司,批号:2019009),甘油三酯(triglyceride,TG)试剂盒(长春汇力生物技术有限公司,批号:2019008),L-甲状腺素钠(BioRuler,批号:r5703),D(+)-无水葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司,批号:20181205),4%多聚甲醛(武汉谷歌生物科技有限公司,批号:G1101)。

1.4 分组及给药

大鼠适应性喂养5天,禁食过夜12小时后,使用便携式血糖测定仪取尾静脉血测量血糖值,测定给葡萄糖前(即0小时)血糖值,再测定给2.5 g/kg体脂量葡萄糖后0.5、2小时血糖值,作为该批次动物基础值[5]。以0、0.5小时血糖水平分为6个组,每组10只,即空白组、模型组、十味消渴组(1.32 g/kg,相当于人体剂量7.92 g/天)、参竹降糖高剂量组(7.5 g/kg,相当于人体剂量45 g/天)、参竹降糖中剂量组(2.5 g/kg,相当于人15 g/天)、参竹降糖低剂量组(1.25 g/kg,相当于人体剂量7.5 g/天)。

从实验第一天开始给每组动物进行预防给药,灌胃时间连续33天(给药体积:1 mL/100 g)。空白对照组不做处理,模型对照组给予同体积溶剂,其余各组灌胃相应药物。

1.5 造模方法

参考《保健食品检验与评价技术规范(2003年版)》辅助降血糖功能评价方法中的胰岛素抵抗糖/脂代谢紊乱模型,结合中医气阴两虚证候的造模方法,建立由劳倦伤脾、T4皮下注射、高脂饲料喂养合并链脲佐菌素注射制备气阴两虚型高血糖大鼠模型[6]。

适应性喂养5天后,开始造模,造模周期维持33天:(1)第一周各组给予维持料饲养,一周后模型组、十味消渴组及参竹降糖高、中、低剂量组更换高热能饲料,喂饲3周。(2)负重游泳力竭运动:在实验的8～21天灌胃给药结束1小时后进行负重力竭游泳运动,在大鼠尾根部负荷其体重10%的铅块,放入0.8 m×0.8 m×1 m的游泳桶内,水深0.7米,水温(20±5)℃,使大鼠在水中不能用尾巴接触桶底,每桶放置2只[7]。力竭标准:①游泳动作明显失调,不能再坚持;②大鼠鼻尖没过水里超过3秒不能回到水面。停止游泳,及时捞起,吹干毛发。(3)T4皮下注射:在实验第22～28天下午14:00进行上颈部皮下注射T4混悬液(0.2 mg/kg)。(4)在实验第28天T4注射结束后,模型组、十味消渴组及参竹降糖高、中、低剂量组禁食24小时(不禁水)[8],在实验第29天给予2%链脲佐菌素溶液(30 mg/kg)一次性腹腔注射(现用现配,取适量链脲佐菌素,锡纸避光于冰块之中避光保存,用0.1 mol/L柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液在冰浴中配置溶液,pH=4.5),注射量为1 mL/100 g体质量[9-12]。注射后继续给予高热能饲料喂饲5天,结束实验。

实验结束后,各组动物禁食12小时,检测空腹血糖值(fasting blood glucos,FBG)、糖耐量、FINS、TC、TG水平。模型组空腹血糖值≥10 mmol/L或0.5小时、2小时任一时间点血糖升高或血糖曲线下面积升高,与空白组相比有显著性差异,判断糖代谢紊乱模型成立[5]。模型组TC或TG明显升高,与空白组比较有显著性差异,判定脂代谢紊乱模型成立。

1.6 检测指标

1.6.1 大鼠证候表征的观察 观察大鼠造模前和造模后证候表征的变化,即大鼠毛色、尿量、排便情况、自主活动的表现。运用电子称,在实验第33天给各组大鼠称量体质量。每日观察记录各组大鼠的肛温、摄食量、饮水量、排尿量、排便量。

1.6.2 血糖测定及相关指数计算 用血糖试纸,按说明书操作,尾尖静脉取血测FBG。胰岛素抵抗指数(homeostasismodel assessment-insulin resistance,HOMA-IR)=胰岛素/22.5e-ln FBG≈(FBG×FINS)/22.5;胰岛β细胞功能指数(homeostasismodel assessment-β,HOMA-β)=20×FINS/(FBG-3.5);胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index,ISI)=ln(l/FINS×FBG)。

1.6.3 大鼠负重游泳力竭运动时间 实验第34天早晨进行最后一次负重游泳力竭运动,记录负重游泳时间。

1.6.4 脏器指数、血脂、胰岛素、甲状腺激素、环核苷酸等指标的检测 实验第33天灌胃结束后禁食不禁水,于第34天早晨进行最后一次负重游泳力竭运动,30分钟后处死动物并取材。巴比妥钠麻醉,腹主动脉取血,300 r/min、离心半径2 cm环境下离心10分钟,取上清,4℃保存待测,取胸腺、脾脏并称重,计算各组大鼠胸腺、脾脏指数,脏器指数=脏器质量(g)/体质量(g)。采用比色法在全自动生化仪上测各组大鼠血清TC、TG、LDL、HDL的浓度。采用酶联免疫法检测血清T3、T4、FINS、cAMP和cGMP的含量,并计算cAMP/cGMP比值。

1.7 统计学处理

实验所得数据为计量资料,使用SAS 9.4统计软件进行统计分析。经检验所有数据均服从正态分布且方差齐,用均值±标准差(±s)表示,组间比较用单因素方差(Oneway ANOVA)分析,两两数据比较用LSD法,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 参竹降糖方对气阴两虚型高血糖大鼠一般状况的影响

实验期间观察模型组大鼠的状态,力竭游泳结束后,大鼠懒动无力、便溏、爪色青紫。注射T4后,大鼠情绪出现躁动,大便稍变干、毛发枯槁、易掉落,饮水量、进食量增加,舌红,小便黄,大便干。注射链脲佐菌素后,大鼠毛发枯黄、无光泽、易脱落,饮水量、饮食量皆显著增加,舌色鲜红,小便增多,大便干、色黑,呈现出气阴两虚的证候表现。在给药后,参竹降糖各剂量组大鼠毛发光泽度增强、脱落现象减少、自主活动正常,舌色红,爪色淡红,大便干、色黑。

2.2 参竹降糖方对气阴两虚型高血糖大鼠体重、饮水量、进食量、排尿量、排便量、肛温的影响

实验第33天,与空白组相比,模型组大鼠体质量显著降低(P＜0.01)。与模型组比较,十味消渴组及参竹降糖高、中、低剂量组大鼠体质量显著升高(P＜0.01)。与空白组比较,模型组大鼠饮水量、进食量、排尿量、排便量、肛温显著升高(P＜0.01)。与模型组比较,十味消渴组及参竹降糖高、中、低剂量组均能使大鼠饮水量、进食量、排尿量、排便量、肛温显著降低(P＜0.01)。见表1。

表1 参竹降糖方对气阴两虚型高血糖大鼠体重、饮水量、进食量、排尿量、排便量、肛温的影响(10只,±s)

表1 参竹降糖方对气阴两虚型高血糖大鼠体重、饮水量、进食量、排尿量、排便量、肛温的影响(10只,±s)

注:与空白组比较,a P＜0.01;与模型组比较,b P＜0.01。

组别 体质量(g) 饮水量(g) 进食量(g) 排尿量(g) 排便量(g) 肛温(℃)10.36±1.21 36.27±0.20模型组 261.3±6.94a 202.9±3.60a 33.95±2.28a 122.8±1.81a 32.4±1.96a 37.66±0.18a十味消渴组 325.4±17.78b 154.8±8.62b 24.49±1.24b 82.7±1.89b 22.6±1.20b 36.99±0.22b参竹降糖低剂量组 299.5±15.88b 155.7±7.28b 22.92±2.83b 81.2±4.59b 22.5±2.17b 36.74±0.25b参竹降糖中剂量组 319.5±15.73b 156.6±6.57b 23.72±2.51b 80.0±4.11b 22.9±2.31b 36.91±0.31b参竹降糖高剂量组 282.8±19.61b 156.9±6.06b 21.85±1.95b 85.4±2.41b 23.23±2.04b 36.82±0.13空白组 378.1±24.58 105.6±3.93 22.3±1.81 31.0±1.49 b

2.3 参竹降糖方对气阴两虚型高血糖大鼠FBG、FINS、HOMA-IR、HOMA-β、ISI的影响

与空白组比较,模型组大鼠FBG、HOMA-IR显著升高,FINS、HOMA-β、ISI显著降低(P＜0.01)。与模型组比较,十味消渴组及参竹降糖高、中、低剂量组大鼠FINS、HOMA-β、ISI显著升高,FBG、HOMA-IR显著降低(P＜0.01)。见表2。

表2 参竹降糖方对气阴两虚型高血糖大鼠FBG、FINS、HOMA-IR、HOMA-β、ISI的影响(10只,±s)

表2 参竹降糖方对气阴两虚型高血糖大鼠FBG、FINS、HOMA-IR、HOMA-β、ISI的影响(10只,±s)

组别 FBG(mmol/L) FINS(pg/mL) HOMA-IR HOMA-β ISI空白组 5.19±0.47 237.11±14.49 51.10±4.90 2909.50±857.90 -7.04±0.10模型组 15.68±4.92a 183.60±18.54a 143.00±53.07a 610.6±216.30a -8.01±0.38a十味消渴组 6.54±0.44b 214.86±28.04b 58.31±9.18b 1410.8±209.70b -7.27±0.18b参竹降糖低剂量组 8.29±2.07b 220.53±9.96b 75.68±24.76b 1375.3±584.10b -7.28±0.29b参竹降糖中剂量组 7.26±2.10b 214.91±27.88b 79.71±20.20b 973.0±357.60c -7.37±0.29b参竹降糖高剂量组 7.29±1.54b 203.93±6.34b 69.89±18.04b 1214.3±462.00c -7.27±0.19 b

2.4 参竹降糖方对气阴两虚型高血糖大鼠血脂的影响

与空白组比较,模型组大鼠TC、TG、LDL显著升高,HDL显著降低(P＜0.01)。与模型组比较,十味消渴组及参竹降糖高、中、低剂量组大鼠TC、TG、LDL显著降低(P＜0.01),HDL显著升高(P＜0.05,P＜0.01)。见表3。

表3 参竹降糖方对气阴两虚型高血糖大鼠血脂的影响(10只,±s,mmol/L)

表3 参竹降糖方对气阴两虚型高血糖大鼠血脂的影响(10只,±s,mmol/L)

注:与空白组比较,a P＜0.01;与模型组比较,b P＜0.01,c P＜0.05。

组别TC TG LDL HDL空白组2.26±0.19 0.93±0.14 1.07±0.08 0.16±0.02模型组 2.49±0.11a 1.14±0.06a 1.26±0.10a 0.10±0.01a十味消渴组 2.14±0.20b 0.87±0.11b 1.11±0.08b 0.12±0.01b参竹降糖低剂量组 2.05±0.14b 0.83±0.03b 0.94±0.05b 0.11±0.01b参竹降糖中剂量组 2.08±0.19b 0.95±0.04b 1.08±0.09b 0.13±0.03b参竹降糖高剂量组 2.03±0.19b 0.82±0.07b 1.03±0.10b 0.13±0.03 c

2.5 参竹降糖方对气阴两虚型高血糖大鼠T3、T4、cAMP、cGMP、cAMP/cGMP的影响

与空白组进行比较,模型组大鼠T3、T4、cAMP及cAMP/cGMP显著升高(P＜0.01),cGMP显著降低(P＜0.01)。与模型组进行比较,十味消渴组大鼠T3有下降趋势,T4、cAMP、cAMP/cGMP显著降低(P＜0.01),cGMP显著升高(P＜0.01);参竹降糖方各剂量组T3、T4、cAMP均显著降低(P＜0.01),cGMP显著升高(P＜0.01)。见表4。

表4 参竹降糖方对气阴两虚型高血糖大鼠T3、T4、cAMP、cGMP、cAMP/cGMP的影响(10只,±s)

表4 参竹降糖方对气阴两虚型高血糖大鼠T3、T4、cAMP、cGMP、cAMP/cGMP的影响(10只,±s)

注:与空白组比较,a P＜0.01;与模型组比较,b P＜0.01,c P＜0.05。

组别 T3(pg/mL) T4(ng/mL) cAMP(pg/mL) cGMP(pg/mL)cAMP/cGMP空白组 586.70±101.70 20.29±1.85 2586.83±384.84 49 1.50±58.35 5.67±0.84模型组 767.67±87.59a 31.17±3.27a 3451.34±495.19a 285.50±33.86a 6.91±0.76a十味消渴组 713.53±106.39 26.07±2.97c 2213.07±381.11c 323.01±43.80b 5.81±0.76c参竹降糖低剂量组 579.82±122.67c 26.37±1.90c 2401.86±256.12c 363.65±37.55c 5.59±0.58c参竹降糖中剂量组 469.48±102.26c 23.52±3.66c 1904.04±392.90c 331.32±40.87b 5.53±0.93c参竹降糖高剂量组 327.53±35.90c 16.05±0.55c 1227.01±254.00c 620.02±187.53c 1.80±0.30 c

2.6 参竹降糖方对气阴两虚型高血糖大鼠脾脏、胸腺的影响

与空白组比较,模型组大鼠脾脏指数、胸腺指数显著降低(P＜0.01)。与模型组比较,十味消渴组及参竹降糖高、中、低剂量组大鼠脾脏指数、胸腺指数均显著升高(P＜0.01)。见表5。

表5 参竹降糖方对气阴两虚型高血糖大鼠脾脏、胸腺的影响(10只,±s)

表5 参竹降糖方对气阴两虚型高血糖大鼠脾脏、胸腺的影响(10只,±s)

注:与空白组比较,a P＜0.01;与模型组比较,b P＜0.01。

组别 脾脏指数 胸腺指数空白组0.00238±0.00034 0.00143±0.00033模型组 0.00180±0.00017a 0.00101±0.00016a十味消渴组 0.00230±0.00016b 0.00162±0.00026b参竹降糖低剂量组 0.00240±0.00020b 0.00145±0.00020b参竹降糖中剂量组 0.00248±0.00023b 0.00136±0.00026b参竹降糖高剂量组 0.00267±0.00026b 0.00140±0.00016 b

2.7 参竹降糖方对气阴两虚型高血糖大鼠力竭游泳的影响

与空白组比较,模型组大鼠力竭游泳时间显著降低(P＜0.01)。与模型组进行比较,十味消渴组及参竹降糖高、中、低剂量组均能延长大鼠力竭游泳时间(P＜0.01)。结果见表6。

表6 参竹降糖方对气阴两虚型高血糖大鼠力竭游泳的影响(±s,秒)

表6 参竹降糖方对气阴两虚型高血糖大鼠力竭游泳的影响(±s,秒)

注:与空白组比较,a P＜0.01;与模型组比较,b P＜0.01。

组别 鼠只 力竭游泳时间空白组10 141.90±23.43模型组 10 53.10±8.35a十味消渴组 10 132.70±40.63b参竹降糖低剂量组 10 121.10±8.99b参竹降糖中剂量组 10 135.00±15.64b参竹降糖高剂量组 10 132.90±16.86 b

3 讨论

本研究依据中医对气阴两虚证的病机认识,从中医整体观念的角度出发,采用强迫大鼠进行负重力竭游泳模拟中医劳倦伤脾,高脂饲料模拟肥甘厚味伤脾损气所致气虚证的发生,T4注射致阴虚,再结合小剂量链脲佐菌素注射,建立高血糖的气阴两虚证候模型[13-14]。参竹降糖方由人参、桑叶、葛根、玉竹、青钱柳、蜂胶组成,方以人参、桑叶为君,益气养阴;葛根、玉竹、青钱柳为臣,生津止渴;蜂胶为佐,补虚化浊止渴。诸品合用,共奏益气养阴、生津止渴之功。根据方中药物的药性药效及主要的功能主治,基于中医方证对应和证效相关理论,此方可用于气阴两虚证,因此可采用以上病证结合模型研究其降血糖功能及益气养阴功效。本实验选取的阳性对照药为十味消渴胶囊(国药准字Z19990033),是由天津中新药业集团股份有限公司乐仁堂制药厂生产的已经上市的降糖中药复方制剂,同样具有益气养阴、生津止渴的中医功效,因其疗效确切,被广泛用于消渴病。因此,以十味消渴胶囊对比研究中药复方益气养阴降血糖作用。

本实验显示,模型大鼠空腹血糖显著升高,TC、TG、LDL显著升高,FINS显著降低,HOMA-IR明显升高,ISI、HOMA-β下降,说明模型大鼠机体内存在糖脂代谢紊乱及胰岛素抵抗。给予参竹降糖方后,能够稳定的控制血糖,使模型大鼠的TG、TC、LDL显著降低,FINS、HDL显著升高,HOMA-IR指数降低,ISI指数、HOMA-β指数提高。说明参竹降糖方能降低血糖,调节脂代谢紊乱,缓解胰岛素抵抗,提高胰岛素敏感性及增强胰岛β细胞功能,显示其具有辅助降血糖的功能。

T3、T4作为下丘脑—垂体—甲状腺轴中甲状腺分泌的关键激素,调节机体产热的功能,同时还有调控机体能量代谢的作用[15]。cAMP、cGMP是反映体液免疫功能的重要指标。cAMP、cGMP作为第二信使参与细胞内能量的代谢,调控能量代谢信号的正常传递,是机体内能量代谢的重要标志,其含量可影响机体神经内分泌功能[16]。在本实验中,与空白组相比,模型组T3、T4显著升高,cAMP升高而cGMP降低,cAMP/cGMP比值显著升高,表明本实验模型组大鼠存在阴虚证候状态。参竹降糖高、中、低剂量组显著降低血清T3、T4含量,降低cAMP含量,升高cGMP含量,显著降低cAMP/cGMP比值[17]。表明参竹降糖方可以调节气阴两虚高血糖大鼠阴虚证候的相关指标,具有养阴生津止渴的功效。

中医认为劳则气耗,大鼠负重力竭游泳时间可以作为气虚的指标[18]。另外,现代研究显示,脾气虚证与免疫功能关系密切,主要表现在细胞免疫、非特异性免疫功能低下。胸腺与脾脏是机体重要的免疫器官,其结构的正常与否直接影响机体的免疫功能。胸腺指数与脾脏指数是反映机体胸腺和脾脏免疫功能的重要指征之一[19]。本实验中模型组大鼠力竭游泳时间与空白组相比明显缩短,脾脏指数、胸腺指数均显著降低。参竹降糖高、中、低剂量组均能明显延长大鼠力竭游泳时间,提高脾脏指数、胸腺指数,表明参竹降糖方具有健脾益气的功效。

同时从模型大鼠的症状上看,饮食量、饮水量、排尿量都显著升高,肛温也明显升高,精神不振、毛发枯黄,无光泽,易脱落、体质量下降、舌色淡红等症状,与临床上气阴两虚证的症状表现相符[20]。参竹降糖方能使模型大鼠饮水量、进食量、排尿量、排便量、肛温降低,体质量逐渐增加,毛色恢复光泽,毛发脱落减少,情绪较为稳定,说明其对气阴两虚证侯表征也有明显的改善作用。

综上,参竹降糖方不仅具有辅助降血糖功能,还能调节脂代谢紊乱,缓解胰岛素抵抗,又能益气养阴、生津止渴,改善体质症状。本配方保健食品,与药物相比作用温和,具有更高的安全性,同时基于辨证保健理论,针对气阴两虚证候状态的血糖偏高人群,为进一步进行中医辨证分型的人体试验研究评价,实现精准保健提供了实验依据。