基于SNP芯片监测通城猪的保种效果

袁 娇，徐国强，周 翔,3,4，徐三平，李 胜，黎望明，刘 榜,3,4*

(1.华中农业大学动物科学技术学院，武汉 430070； 2.华中农业大学 农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，武汉 430070； 3.生猪健康养殖省部共建协同创新中心，武汉 430070；4．湖北省地方猪品种改良工程技术研究中心，武汉 430070； 5．通城县国营种畜场，通城 437400)

通城猪(Tongcheng pig)产于湖北省通城县，是“华中两头乌猪”的代表类群，2000年被列入《国家级畜禽品种资源保护名录》，具有肉质嫩美、鲜香味浓、抗逆性强及抗高致病性蓝耳病等种质特性，是我国养猪业可持续发展、打好种业翻身仗的重要遗传资源之一。通城猪遗传资源保护(下称“保种”)严格按照“以保为先，以用促保，保用结合”方针展开，建立以保种场和保护区的原位保种为主、种质冷冻保存等生物技术保种为辅的保种体系。在保种的同时做好通城猪的利用，筛选出最优杂交组合的优质商品猪“鄂青一号”，已在湖北省及其周边省份成功推广。在深入挖掘通城猪优良肉质和抗蓝耳病的种质特性基础上，培育了抗病优质新品种，新品种在保留通城猪优良肉质等主要种质特性的基础上，生长速度和瘦肉率显著提高，且对蓝耳病有较强的抗病力。

近年来，受非洲猪瘟的影响，通城猪也和其他地方猪种一样面临着严峻的挑战，目前通城猪的保种效果如何? 基于小群体活畜保种理论，可从群体结构和遗传多样性两方面进行评价。常用群体分层、遗传距离、亲缘关系、公猪家系数量等指标来反映群体结构；用等位基因频率、有效等位基因数(effective number of alleles，)、多态信息含量(polymorphism information content，)、杂合度、有效群体含量(effective population size，)和连续性纯合片段(runs of homozygosity，ROH)等参数来评估遗传多样性。群体结构和遗传多样性的研究方法随着分子标记及其检测技术的发展而不断改变，目前数量多、覆盖率高和稳定性好的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)成为进行遗传分析常用的分子标记，在猪、牛、羊、马、鸡、驯鹿等物种的群体结构和遗传多样性研究中得到广泛使用。基因组测序技术的进步和SNP芯片的发明实现了从全基因组水平进行SNP扫描和基因分型，使得对群体结构和遗传多样性的评价更加全面和准确。本研究将利用“中芯一号”("Zhongxin No.1")SNP 芯片对通城猪保种群体进行全基因组扫描和分析，评估通城猪保种场多年的保种效果，为通城猪遗传资源的进一步保护和利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以通城县国营种畜场15个血统(系谱记录)中具代表性的20头公猪及48头繁殖母猪为研究对象，采集耳组织样品并用苯酚-氯仿法提取DNA。利用“中芯一号”50K SNP芯片在北京康普森生物技术有限公司对通城猪进行全基因组SNPs检测，累计得到51 315个SNPs，利用Plink(v 1.90)软件质控后得到的26 999个SNPs进行群体结构和遗传多样性分析。

1.2 方法

1.2.1 群体结构分析 主成分分析(principal component analysis，PCA)是使用GCTA(v 1.93)软件按Price等提出的EIGENSTRAT方法计算前2个主成分，分析结果通过R(v 4.0.2)软件进行可视化。利用基因型信息构建保种个体基因组加性遗传相关矩阵，即亲缘关系G矩阵：

公式中，为×标准化的基因型矩阵，为标记个数，为分型个体数；为第i个位点最小等位基因频率。

根据连锁不平衡分析利用Plink(v 1.90)软件去除冗余位点，以50个SNPs为一个窗口，每次步移5个SNPs，r的阈值为0.6，去除强连锁位点，再进一步基于状态同一(idendity by state，IBS)分析个体间遗传距离(distance，D)。基于20头公猪遗传距离用R(v 4.0.2)及MEGA(v 11.0.10)软件进行聚类分析并构建系统进化树，以3代内无亲缘关系划分公猪家系，依据个体间遗传距离：D=1-r(r为个体间亲缘关系)将亲缘系数0.062 5作为划分公猪血统的依据，并进行可视化。

1.2.2 遗传多样性分析 通过Plink(v1.90)软件计算等位基因频率，每个基因座上等位基因一个亲本为杂合子另一个亲本为不同基因型的概率为多态信息含量()，群体内多态性基因座所占比例为多态性标记比()，群体中杂合子所占比率为观测杂合度(observed heterozygosity，)，群体内随机抽取两等位基因各不相同的概率为期望杂合度(expected heterozygosity，)。基于杂合度衡量理想群体中一个基因座上产生与实际群体中相同杂合度所需要的等位基因数目为有效等位基因数()，的计算也通过Plink(V1.90)软件实现。利用TASSEL(v 5.0)软件计算每个位点上核苷酸差异的平均值，得到核苷酸多样性()。

历史有效群体含量()通过SNeP(v 1.1)软件利用连锁不平衡程度进行分析，计算公式为：

而当前世代的是根据数量遗传学理论计算的，若群体中公、母畜的数量分别设为N和N，则群体在各家系等量留种的情况下为：

群体每一世代的近交增量为：

通过Plink(v 1.90)软件检测基因组上出现的一定数量和密度SNPs表现为纯合的区域，即为连续性纯合片段(ROH)，主要参数如下：20个SNPs的滑动窗口沿染色体滑动、每个滑动窗口的杂合子个数不超过1个、最小长度>10 kb，SNP个数/ROH>20、最小SNP密度>1 000 kb/SNP。基于个体的ROH总长度和基因组的总长度可计算个体基因组近交系数()，计算公式如下：

式中，∑为一个个体检测到的所有ROH的长度之和，为常染色体基因组总长度。本研究为排除全同胞对计算的影响，仅计算41头无全同胞关系个体的基因组近交系数。

2 结 果

2.1 群体结构

通城猪保种群主成分分析中PC1和PC2主成分可解释的遗传变异分别为6.92%、5.19%，种群内个体也有很好的分散，20头种公猪均未见明显聚集，这表明保种群的群体结构无明显分层(图1)。基于IBS遗传距离矩阵和亲缘关系矩阵分析群体结构(图2和图3)，群体内个体间的遗传距离平均值为0.27±0.02，范围为0.14～0.31，亲缘系数平均为0.17，保种群大多数个体间具有中等程度的亲缘关系。基于20头公猪的遗传距离构建系统进化树，按亲缘系数小于0.062 5的标准划分公猪家系，共分为10个公猪家系(图4)。

图1 通城猪PCA分析结果Fig.1 PCA analysis results of Tongcheng pigs

图中每一个小方格代表第一个到最后一个个体两两之间的遗传距离，该值越大小方格越接近橙色，反之越接近蓝色。图中编号m代表公猪，f代表母猪，m和f后的数字代表个体号，下同Each small square in the figure represents the genetic distance between the first and last individuals. The larger the value, the closer the square is to orange, and vice versa, the closer to blue. The m in the figure represents the boar, and f represents the sow, the numbers after m and f represent individual numbers,the same as below图2 遗传距离矩阵可视化结果Fig.2 Visualization results of genetic distance matrix

图中每一个方格代表第一个到最后一个个体两两之间的亲缘关系值，该值越大越接近于橙色，反之越接近蓝色Each small square in the figure represents the relationship coefficient value between the first and last individuals. The larger the value, the closer to orange, and vice versa, the closer to blue图3 亲缘关系G矩阵可视化结果Fig.3 Visualization results of genetic relationship G matrix

图中数字代表公猪样品编号，纵坐标代表遗传距离，红线代表亲缘系数值为0.062 5The number represents the boar individual number, the ordinate represents the genetic distance, and the red line represents the relationship coefficient is 0.062 5图4 20头公猪遗传距离聚类图Fig.4 Clustering diagram of genetic distance of 20 boars

2.2 遗传多样性分析

遗传多样性评估参数计算结果见表1，其中等位基因频率为0.77、有效等位基因数为1.52、多态信息含量为0.31、观测杂合度为0.32，期望杂合度为0.31，这些结果表明，通城猪保种群具有丰富的遗传多样性。

表1 通城猪遗传多样性相关参数统计

基于连锁不平衡计算历史世代有效群体含量()，通城猪1 000代前=2 245头、500代前=978头、20代前=105头，历史世代的表明，通城猪的有效群体含量呈逐代下降的趋势(图5)。通城猪保种场一直采用各家系等数留种方式进行选留，根据留种方式计算通城猪当前世代为94头，近交增量为0.53%。从全基因组水平对通城猪群体进行连续性纯合片段(ROH)分析，共发现184个ROHs，平均ROH长度为23.71 Mb，范围在11.26～69.02 Mb之间，主要集中在15～20 Mb之间(占28.80%)；ROH集中分布在1、2、3、13号染色体上，其中13号染色体ROH数量最多为22个(图6)。对通城猪个体进行分析，其ROH数量在1～9个 之间，长度主要分布在50～75 Mb之间，平均ROH总长度为(71.97±52.95) Mb(图7)。基于全基因组ROH估计通城猪基因组近交系数()为0.04%。

图5 通城猪的历史有效群体含量Fig.5 Historical effective population size (Ne) of Tongcheng pigs

A.不同染色体的ROH数量分布；B.不同长度的ROH数量分布A.Distribution of ROH numbers on different chromosomes; B. Distribution of ROH numbers with different lengths图6 通城猪基因组ROH数量及分布Fig.6 Number and distribution of ROH in the genome of Tongcheng pigs

A.不同ROH数量的个体分布；B.个体的ROH总长度分布A.ROH quantity distribution of individuals; B. ROH length distribution of individuals图7 通城猪个体ROH分布Fig.7 ROH distribution of all individuals in Tongcheng pigs

3 讨 论

畜禽遗传资源保护(简称保种)的本质是保护遗传多样性。通城猪作为优质抗逆地方品种代表之一，自20世纪80年代建立通城县国营种畜场(通城猪保种场)以来，在农业农村部和地方政府的支持下保种工作已持续近40余年。本研究利用全基因组SNP信息从群体结构和遗传多样性两个方面评估保种场多年的保种效果。

在群体结构研究中，通过主成分分析表明通城猪保种群是一个没有分层的纯种群体。群体中个体间的遗传距离范围在0.14～0.31之间，较2013年对通城猪(12头)的分析结果(0.11～0.23)远，这可能是由于样本含量差异导致。通城猪遗传距离平均为0.27，高于青裕猪，低于马身猪和蓝塘猪，3个 品种分别为0.26±0.03、0.29、0.33±0.03，这表明通城猪群体具有适中的遗传距离。公猪家系数量是保种成败的关键，长期以来通城猪保种场系谱记载血统数量为15个，本研究结合遗传距离以及亲缘系数将20头种公猪划分为10个基因组家系，以亲缘系数为0.062 5作为划分家系的阈值。阈值的设置是基于不同的公猪血统其3代内没有亲缘关系，若3代内有亲缘关系即为近交个体，其近交系数为0.031 25；若个体间没有近交，其近交系数至少应当小于0.031 25，那么亲缘系数应小于0.062 5。不论是系谱记录的家系还是基因组家系数量都满足农业农村部颁布的《畜禽遗传资源保种场保护区和基因库管理办法》文件对公猪家系数量的要求。基因组家系为通城猪进一步的保种提供了新的策略，对于同一基因组家系的不同系谱记录家系，可通过选配构建出不同的基因组家系，进一步增加通城猪的基因组家系数量。

本研究中通过等位基因频率、有效等位基因数、多态信息含量、多态性标记比例、杂合度、核苷酸多样性等参数从多态性和杂合性度量遗传多样性，利用有效群体含量()、连续性纯合片段(ROH)以及近交程度评估保种效果。等位基因频率为0.5时群体中杂合基因型频率最高，也就是说群体遗传多样性最丰富，通城猪等位基因频率均值为0.77，群体的遗传多样性丰富。杂合度是度量遗传变异的一个重要指标，杂合度越高的群体其遗传多样性越丰富，本研究中通城猪的观测杂合度和期望杂合度均与本课题组在2015年的研究结果(为0.32，为0.31)相一致，高于大部分其他主要中国地方猪种(为0.14～0.26，为0.15～0.29)，说明保种群体杂合度高且比较稳定。从多态信息含量分析，通城猪基因组大部分位点为中度多态位点(0.25<<0.5)，本课题组前期通过全基因组测序研究也发现，在通城猪基因组存在7百万个SNPs位点，这些结果均表明通城猪具有丰富的遗传多样性。

有效群体含量()是评价保种效果的一个重要指标。越大，群体受遗传漂变的影响越小，更有利于维持高的杂合度，种群维持能力更强。通城猪保种群20世代前为105头，与其他“华中两头乌”类群如赣西两头乌(84)、沙子岭猪(85)相比较具有更大的。有效群体含量的大小主要受群体中数量少的性别的影响，也就是说公猪对的影响更大，要想提高有效群体含量来确保保种效果，就要增加群体中公畜的数量。ROH普遍存在于受选择强度密集的基因组区域内，该区域基因纯合将导致遗传多样性降低，一般来说，选择强度大的商业品种具有更长、更多的ROH，其ROH平均长度范围在23.3～286 Mb之间，而中国地方猪种在1.8～245 Mb之间，与其他品种相比，通城猪平均ROH长度(23.71 Mb)处于较低水平，同时基于ROH计算的近交系数(0.04%)低于近交个体的两种阈值0.781%或3.125%，这表明通城猪遗传多样性受到了非常好的保护。

4 结 论

通城猪保种群是一个没有分层的纯种群体，具有丰富的遗传多样性，表明通城猪得到了有效保护。