C-末端Src 蛋白/黏着斑激酶/上皮钙黏素通路在宫颈癌侵袭转移中的作用及机制研究

唐群华 母小琴 黄仕兰 唐志康 廉晓玲

湖南医药学院第一附属医院妇科，湖南怀化 418000

宫颈癌严重威胁女性的生命和健康[1]，中晚期患者由于淋巴结和远处转移，导致临床疗效不佳[2]。上皮钙黏素（E-cadherin，E-cad）是重要的上皮细胞固有黏附分子，也是上皮性肿瘤侵袭转移的抑制分子[3-4]。C-末端Src 蛋白（C-terminal Src protein，c-Src）/黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）作为互助型复合体具有重要的信号调控功能[5-6]。本研究以宫颈癌组织及细胞系为研究对象，探讨c-Src/FAK/E-cad 通路在宫颈癌侵袭转移中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

选取宫颈鳞癌（cervical squamous cell carcinomas，CSCC）组织标本30 例、正常宫颈（normal cervical，NC）组织标本30例，以上石蜡标本均来源于2019 年1 月至2020 年12 月湖南医药学院第一附属医院（以下简称“我院”）病理科，其中CSCC 中Ⅰ期5 例，Ⅱ期7 例，Ⅲ期10 例，Ⅳ期8 例。另选取我院术中采集的CSCC、NC 组织各1 例。宫颈癌Caski 细胞系来源于我院中心实验室。c-Src 抑制剂（AZD0530）购自碧云天生物技术公司，分子量542 kD。宫颈癌Caski 细胞系分为Caski 组、Caski+c-Src 抑制剂组，Caski 组不进行处理，Caski+c-Src 抑制剂组加入c-Src 抑制剂，使用浓度为2.7 nmol/L[7]。本研究经我院医学伦理委员会审批。

1.2 免疫组织化学染色

采用免疫组织化学染色观察CSCC 与NCT 中E-cad 阳性率。采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法，按试剂盒（福州迈新生物技术公司，KIT-9720）说明书操作。步骤如下：CSCC、NC 石蜡标本常规脱蜡切片，加一抗，浓度为c-Src（1∶500），4℃冰箱过夜后加入二抗（1∶500）；辣根过氧化物酶法显色，苏木精复染，常规脱水，透明，干燥，封片。结果判断[8]：①按染色深度评分。无染色记为0 分，浅黄色记为1 分，棕黄色记为2 分，深棕色记为3 分。②按阳性细胞比率评分。阳性细胞数占总细胞数＜10%记为0 分；10%～＜25%记为1 分；25%～＜50%记为2 分；≥50%记为3 分。③2 项评分相加。0～1 分为阴性，2 分为弱阳性，3～4 分为阳性，5～6 分为强阳性。阳性率=（弱阳性+阳性+强阳性）/总数×100%。

1.3 E-cad 表达情况与CSCC 临床病理特征关系

收集30 例CSCC 患者的临床病理特征，包括年龄、国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obste-trics，FIGO）分期、分化程度、复发情况、淋巴结转移情况，分析其与E-cad 表达情况的关系。

1.4 Western blot 检测c-Src、FAK、E-cad 蛋白表达水平

采用Western blot 观察CSCC、NC 组织中c-Src、FAK、E-cad 蛋白的表达情况。CSCC、NC 组织剪碎研磨，加裂解液；4℃，12000 g 条件下离心30 min，吸取上清液为蛋白样品；水浴变性；SDS-PAGE 电泳；将分离胶中蛋白转到PVDF 膜上；丽春红染色；脱脂奶粉封闭；将PVDF 膜放入杂交袋中，加封闭液和一抗（c-Src、FAK、E-cad 浓度均为1∶1000），冰箱中过夜；加封闭液和二抗，浓度1∶1000；扫描凝胶并照相。Caski 组、Caski+c-Src 抑制剂组无需前处理，直接检测即可。实验重交3 次。

1.5 侵袭及迁移实验

侵袭实验：首先将Matrigel 胶与无血清培养基按1∶100 混合，浸泡小室，在上腔加100 μl 基质胶，紫外线消毒杀菌过夜；上腔加200 μl，下腔加600 μl 无血清培养基；收集细胞，密度为2×105个/ml，上下腔中加入200 μl 细胞，并加入含10%胎牛血清的1640 培养基，48 h 后取出，加无水乙醇固定，结晶紫染色，计数10 个高倍视野中细胞数目。迁移实验不需要Matrigel胶，其余步骤同侵袭实验。

1.6 流式细胞术

采用流式细胞术观察c-Src 抑制剂对Caski 细胞系凋亡的影响。Caski 组、Caski+c-Src 抑制剂组分别用胰蛋白酶消化细胞，制成悬液，保留沉淀加入缓冲液，将细胞吹打均匀，加入Annexin V 及染色剂，混匀，计算机检测细胞凋亡率。实验重交3 次。

1.7 统计学方法

采用SPSS 18.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，比较采用t 检验；计数资料采用例数表示，比较采用χ2检验和Fisher确切概率法。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 CSCC、NC 组织标本中E-cad 阳性率比较

NC 组织标本的E-cad 阳性率（76.7%，23/30）高于CSCC 组织标本（26.7%，8/30），差异有统计学意义（χ2=15.017，P ＜0.001）。见图1。

图1 宫颈鳞癌、正常宫颈组织标本中上皮钙黏素阳性率比较（免疫组织化学染色，200×）

2.2 CSCC 患者临床病理特征与E-cad 的表达的关系

E-cad 表达与CSCC 患者的FIGO 分期、分化程度、复发情况相关联（P ＜0.05）。见表1。

表1 CSCC 患者临床病理特征与E-cad 的表达的关系（例）

2.3 CSCC、NC 组织中c-Src、FAK、E-cad 蛋白表达水平比较

CSCC 组织中c-Src、FAK 表达水平高于NC 组织，E-cad 表达水平低于NC 组织，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图2。

图2 NC 组织、CSCC 中c-Src、FAK、E-cad 蛋白表达水平比较（n=3）

2.4 Caski 组、Caski+c-Src 抑制剂组细胞侵袭、迁移能力比较

Caski+c-Src 抑制剂组侵袭、迁移细胞计数均低于Caski 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表2。

表2 Caski 组、Caski+c-Src 抑制剂组细胞侵袭、迁移能力比较（个/10 HP，±s，n=3）

表2 Caski 组、Caski+c-Src 抑制剂组细胞侵袭、迁移能力比较（个/10 HP，±s，n=3）

2.5 Caski 组、Caski+c-Src 抑制剂组细胞凋亡率的比较

Caski+c-Src 抑制剂组细胞凋亡率为（14.6±0.8）%，Caski 组细胞凋亡率为（5.1±0.2）%，Caski+c-Src 抑制剂组细胞凋亡率高于Caski 组，差异有统计学意义（t=19.953，P ＜0.001）。

2.6 Caski 组、Caski+c-Src 抑制剂组c-Src、FAK、E-cad蛋白表达水平比较

Caski+c-Src 抑制剂组c-Src、FAK 蛋白表达水平低于Caski 组，E-cad 蛋白表达水平高于Caski 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图3。

图3 Caski 组、Caski+c-Src 抑制剂组c-Src、FAK、E-cad 蛋白表达水平比较（n=3）

3 讨论

E-cad 缺失能够诱导上皮间质转化发生，导致肿瘤侵袭转移能力增强[9-11]。在宫颈癌浸润及转移灶中大部分E-cad 表达缺失[12]。本研究发现，E-cad 在NC 组织中高于CSCC，且E-cad 表达与肿瘤分化程度、FIGO分期、复发有关，提示E-cad 表达与宫颈癌发生发展有关。

有研究发现，E-cad 表达和功能受c-Src/FAK 的调控[13]。c-Src 在调控细胞生长增殖、黏附等方面发挥重要作用[14-17]。FAK 是一种非受体酪氨酸蛋白激酶，是整合素信号的中心分子[18]；而整合素介导FAK 活化对于细胞播散和迁移至关重要[19]。

c-Src 和FAK 以c-Src/FAK 复合体形式于人体中存在并发挥作用[20]。c-Src/FAK 复合体参与调节细胞凋亡、迁移等病理生理过程[21-22]。在头颈鳞癌、肺癌中，均存在FAK 高表达[23-25]。FAK 增高可促进肿瘤细胞迁移和侵袭能力[26-27]。FAK 在宫颈癌中高表达，且与宫颈癌恶性程度有关[28]。

本研究结果显示，CSCC 组织中c-Src、FAK 表达增高，E-cad 表达下调，加入c-Src 抑制剂后，宫颈癌细胞侵袭和迁移能力下降，凋亡增多，宫颈癌细胞中c-Src、FAK 下调，E-cad 表达上调。

综上，CSCC 中，c-Src 表达下调可引起FAK 下调和E-cad 表达上调，导致宫颈癌侵袭和迁移能力下降，可能与细胞凋亡增多有关，对于宫颈癌靶向治疗具有重要意义。