高效液相色谱法同时测定湿润烧伤膏中12 种成分含量

庹 娅，刘小卫，蒋 蕾

（重庆市南川区中医医院，重庆 408400）

湿润烧伤膏是由黄连、黄柏、黄芩、地龙及罂粟壳制成的软膏剂，呈浅棕黄色至深棕黄色，具有麻油香气，具有清热解毒、止痛和生肌等功效，临床主要用于各种烧、烫、灼伤的治疗。临床药理学研究表明，其还对压疮、湿疹及糖尿病性皮肤溃疡有较好疗效［1-4］。湿润烧伤膏收载于国家药品标准［WS3- 043（Z - 005）-2002（Z）］，其中仅要求对盐酸小檗碱及黄芩素进行定量检测。目前，尚未见湿润烧伤膏中有效成分含量的相关研究。为此，本研究中建立了测定湿润烧伤膏中5 种黄酮类化合物（黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A）及7 种生物碱类成分（黄柏碱、木兰花碱、黄连碱、表小檗碱、药根碱、小檗碱、巴马汀）含量的高效液相色谱（HPLC）法，为该制剂质量评价及标准提升提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；AB135 - S 型电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；SK8210 HP 型超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2 试药

湿润烧伤膏（汕头市美宝制药有限公司，批号分别为 190805，190806，191101，191202，200504，200508，200701，200802，200803，200805，规格为每支40 g）；盐酸巴马汀对照品（批号为110732 - 201812，含量97.6%），盐酸黄柏碱对照品（批号为111895-201805，含量94.9%），盐酸黄连碱对照品（批号为112026 -201802，含量94.0%），盐酸小檗碱对照品（批号为110713-201613，含量86.8%），盐酸药根碱对照品（批号为110733-201609，含量89.5%），黄芩苷对照品（批号为110715 - 201821，含量95.4%），汉黄芩苷对照品（批号为112002-201501，含量98.9%），黄芩素对照品（批号为111595-201607，含量98.5%），汉黄芩素对照品（批号为111514-201605，含量96.5%），均购自中国食品药品检定研究院；盐酸表小檗碱对照品（批号为PB0043），氯化木兰花碱对照品（批号为PX0026），均购自成都普利斯生物科技有限公司，含量均大于98%；千层纸素A 对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号为100826，含量98%）；甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。黄连（批号为200510）、黄柏（批号为20201005）、黄芩（批号为191103）、地龙（批号为20190912）、罂粟壳（批号为201101 - 1）饮片均购自安徽亳州药材大市场，经重庆市南川区中医医院胡沈星副主任药师鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

5 种黄酮类成分：色谱柱为Phenomenex Luna C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm）；流动相为乙腈（A）- 0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～5 min 时8%A→18%A，5～12 min时18%A，12～20 min时18%A→25%A，20～32 min时25%A → 40%A，32～50 min 时40%A → 55%A，50～60 min 时 55%A，60～70 min 时 55%A → 8%A）；流速为1.0 mL/min；检测波长为275 nm；柱温为35 ℃；进样量为10µL。

7种生物碱类成分：色谱柱为Agilent Zorbax SB C18柱（250 mm × 4.6 mm，5µm）；流动相为0.02 mol/ L 磷酸二氢钾溶液（磷酸调pH 至4.0）- 乙腈（65∶35，V/V）；流速为1.0 mL/min；检测波长为345 nm；柱温为30 ℃；进样量为10µL。

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：分别取黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为4.970，1.250，1.014，0.249，0.258 mg/ mL的混合对照品贮备液Ⅰ；精密量取1 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，经0.45µm滤膜滤过，取续滤液，即得混合对照品溶液Ⅰ。分别取盐酸黄柏碱、氯化木兰花碱、盐酸黄连碱、盐酸表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为1.839，3.479，7.634，3.956，2.495，25.547，7.276 mg/mL的混合对照品贮备液2，精密量取1 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，经0.45µm 滤膜滤过，取续滤液，即得混合对照品溶液Ⅱ。

供试品溶液：取样品约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇50 mL，称定质量，超声（功率250 W，频率40 kHz，下同）处理60 min，放冷，滤过，再次称定质量，用水饱和正丁醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：按湿润烧伤膏处方工艺及比例，分别制得缺黄芩和缺黄连、黄柏的阴性样品，按供试品溶液制备方法，分别制成缺黄芩的阴性对照品溶液Ⅰ和缺黄连及黄柏的阴性对照品溶液Ⅱ。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：精密吸取2.2项下各溶液适量，按2.1项下相应色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱中，在与混合对照品溶液Ⅰ和Ⅱ色谱相应位置有吸收峰。理论板数按黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A峰计均应不低于5 000，按小檗碱、黄连碱、黄柏碱及药根碱峰计均应不低于4 500，分离度均大于1.5，基线分离良好。详见图1和图2。

图1 黄酮类成分高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of flavonoids

图2 生物碱类成分高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of alkaloids

线性关系考察：取混合对照品贮备液Ⅰ和Ⅱ，加70%甲醇溶液分别制成系列混合对照品溶液，按2.1项下相应色谱条件进样测定，记录峰面积。以各成分质量浓度（X，mg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，回归方程及线性范围见表1。

检测限与定量限考察：精密吸取混合对照品溶液Ⅰ和Ⅱ，加70%甲醇倍比稀释，按2.1 项下相应色谱条件进样测定，以信噪比（S/N）为3∶1 和10∶1 时的进样量分别记作检测限和定量限。结果见表1。

精密度试验：取供试品溶液适量，按2.1 项下相应色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果见表1，表明方法精密度良好。

表1 方法学考察结果（n=6）Tab.1 Results of the methodological investigation（n=6）

稳定性试验：取供试品溶液适量，分别于室温下放置0，3，6，9，12，15，18，24 h 后，按2.1 项下相应色谱条件进样测定，记录峰面积。结果见表1，表明室温下供试品溶液放置24 h内稳定。

重复性试验：取样品适量，按2.2 项下方法平行制备供试品溶液6 份，按2.1 项下相应色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算各成分含量。结果见表1，表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量样品1.0 g，精密称定，平行6 份，置具塞锥形瓶中，每份精密加入2.2 项下相应混合对照品贮备液Ⅰ和Ⅱ各2.5 mL，再按2.2项下供试品溶液制备方法处理，按2.1项下相应色谱条件进样测定，记录峰面积，计算加样回收率。结果见表1。

2.4 样品含量测定

取样品10 批，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下相应色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算12种成分的含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果（mg/g，n=3）Tab.2 Results of content determination of 12 components in samples（mg/g，n=3）

3 讨论

3.1 成分解析

黄连、黄芩同属苦寒之品，有清热燥湿、泻火解毒之功效，黄连偏泻心胃之火，黄芩善解肺及大肠之热，二者常配对使用，以协同发挥疗效［5］。黄芩中主要含有黄酮类、木脂素和挥发油等多种成分，其中黄酮类化合物为其主要药理活性成分，如黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A 等［6］。药理学研究表明，黄芩素可抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡，黄芩苷具有抗氧化、抗心肌缺血、抗肿瘤及抗炎等功效，汉黄芩素可抑制多种肿瘤细胞生长增殖［7-11］。黄连的主要活性成分为表小檗碱、小檗碱、黄连碱、巴马汀等异喹啉类生物碱，具有抗菌、消炎、增强机体免疫功能、抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡等作用［12-14］。黄连- 黄芩配伍主治上焦、中焦火邪及清热毒，黄柏则入肾经、大肠经、膀胱经，清下焦火；黄柏的活性成分主要为生物碱类，包括小檗碱、药根碱、木兰花碱、黄柏碱等［15-16］。

3.2 色谱条件优化

本研究中12 种成分可分为黄酮类及生物碱类成分，化学结构差异较大，预试验中参考文献［17］方法，以甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相，同时测定12种成分，但基线噪音较大，色谱峰分离效果欠佳，尤其巴马汀与小檗碱难以分离。为得到较好的分离效果和信号强度，最后采用不同色谱条件分别测定湿润烧伤膏中两大类成分，且选择不同流动相进行分离。通过对12种成分进行紫外-可见光全波长紫外扫描，发现7种生物碱类成分在345 nm 波长处均有较强吸收，而5 种黄酮类化合物在275 nm 波长处有较强吸收，所以本研究中设置两种检测波长。

3.3 提取方式选择

杨丽宏等［17］分别采用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、纯净水等不同极性试剂，提取黄连解毒汤中生物碱类及黄酮类化合物，得出以饱和正丁醇溶液提取效果最好的结论，预试验中分别比较了不同浓度的甲醇溶液、饱和正丁醇溶液及0.1%甲酸溶液对各成分的提取效果，结果与文献结果一致，故以饱和正丁醇为提取溶剂，超声提取湿润烧伤膏中12种成分。

3.4 方法评价

本研究中首次实现了湿润烧伤膏中5 种黄酮类化合物（黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A）及7 种生物碱类成分（黄柏碱、木兰花碱、黄连碱、表小檗碱、药根碱、小檗碱、巴马汀）含量的同时测定，方法精密度高、准确性和重复性好，可为该制剂质量评价和标准提升提供参考。