南洞庭湖地区杨树清理迹地典型植物叶际微生物群落结构

邓 楠，田育新，宋庆安，田 菲，马丰丰①，罗学卫，李德先，严静芬

(1.湖南省林业科学院，湖南 长沙 410004；2.湖南慈利森林生态系统国家定位观测研究站，湖南 慈利 427200；3.益阳市南洞庭湖自然保护区沅江市管理局，湖南 沅江 413100)

洞庭湖为长江流域仅有的两个大型通江湖泊，是我国第2大淡水湖和全球生态优先保护区[1-3]。自20世纪70年代以来，由于天然林保护工程的实施和国家木材需求的增长，洞庭湖区域引入以杨树为主的速生用材林作为护堤防浪林和抑螺血防林，为发展地方经济，扩大了湖区杨树种植面积；90年代后期，杨树在东洞庭湖的漉湖、资江三角洲、湘江三角洲，南洞庭湖西部洲滩以及西洞庭湖目平湖洲滩呈块状大片分布。1987—2014年，西洞庭湖杨树林面积从0增长到10 153 hm2，到2011年杨树林面积持续增加，2011年实施的“退林还湿”工程砍伐了部分区域的杨树，致使杨树林面积减少至2014年水平[4]。杨树的大面积种植引起了生物多样性、生境、湿地群落结构和功能等方面的连锁影响。2017年，中央环保督察组在对湖南的反馈中指出湖区大面积种植欧美黑杨已严重威胁洞庭湖生态安全，要求将洞庭湖自然保护区核心区内的杨树全部清理。2017年10月湖南省林业厅制定出缓冲区、实验区内杨树清理退出方案，要求采取科学措施，修复被破坏的湿地生态系统。该方案提出2018、2019和2020年分别退出杨树总面积的30%、40%和30%，到2020年，全面清理退出。对防护林、抑螺林进行树种调整，并实施生态修复；恢复湿地4.33万hm2，整治岸线11.14 km、洲滩168处，湿地保护率稳定在72%以上。杨树清理后，产生了大量清理迹地，为此，湖南省林业厅制定相关方案，对清理迹地采取以自然修复为主、以人工修复为辅的技术手段，通过清理采伐剩余物、除树兜、除萌、封育、封沟育洲和平沟育洲等修复措施，逐步恢复植被和湿地生态系统结构、功能及生物多样性。

自然环境中，植物地上和地下组织中都存在微生物群落，叶际微生物一般是指生活在植物地上部分、主要栖息于叶片的微生物群落[5]。叶际微生物生存的叶面总面积超过1亿km2，约为全球陆地面积的两倍[6]，据估计，其细菌个体总数约为1026个，而真菌数量可能要低于细菌总数[7-8]。叶际微生物可改变宿主的功能或环境适应性，进而影响植物的分布和生态功能[9]。通常来说，叶际微生物对宿主会产生有利、有害及中性作用[5,10-11]。目前，已有研究表明叶际微生物对宿主的有利作用包括改变宿主微环境、促进生长、作为外源基因载体以及吸附和降解环境污染物等。叶际中获得的鞘单胞菌属(Sphingomonasspp.)能够分泌吲哚乙酸等促进植物生长[12]。有研究表明在非豆科植物中的叶际微生物与根际微生物相似，叶际中存在大量固氮菌，在植物的固氮[13]、硝化作用和溶解磷酸盐[14]过程中起到重要作用。丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)菌株产生的生物活性分子及蛋白酶体抑制剂Syringolin A通过引导气孔关闭来阻止病原体的进入[15]。随着高通量测序技术及生物信息分析工具的快速发展，微生物群落与植物互作关系已成为重要热点和前沿[16]，但植物与微生物互作研究大部分集中于根际微生物[17]。相比较而言，叶际微生物群落研究随着二代测序技术的发展正逐渐成为热点之一[18]。

以南洞庭湖杨树清理迹地天然更新的杨树(Populusspp.)、苔草(Carexspp.)、芦苇(Phragmitescommunis)、南荻(Triarrhenalutarioriparia)以及原有的芦苇群落叶际微生物为研究对象，通过基于16S rRNA/ITS1片段的HiSeq高通量测序技术，解析不同植物群落叶际真菌和细菌群落结构及组成差异，为洞庭湖杨树清理迹地生态修复提供理论支持，也为理解叶际微生物与宿主植物的互作关系提供更多案例。

1 材料与方法

1.1 采样地点与方法

研究地点位于湖南省沅江市南洞庭湖，杨树清理迹地天然更新后地表主要植被为芦苇、南荻、苍耳(Xanthiumsibiricum)、臭牡丹(Clerodendrumbungei)、豆瓣菜(Nasturtiumofficinale)、附地菜(Trigonotispeduncularis)、蒌蒿(Artemisiaselengensis)、婆婆纳(Veronicadidyma)、水蓼(Polygonumhydropiper)、苔草和通泉草(Mazusjaponicus)等，选取芦苇群落(编号：LW，28°49′23.35″ N，112°30′13.20″ E)、南荻群落(编号：ND，28°50′3.61″ N，112°29′55.94″ E)、苔草群落(编号：TC，28°51′38.60″ N，112°33′39.06″ E)和杨树群落(编号：YS，28°54′39.71″ N，112°30′58.92″ E)代表性优势植物群落，同时选取该区附近原生的芦苇群落(编号：CK，28°49′23.38″ N，112°30′13.35″ E)进行对比。采样时间为2019年9月24日，叶际微生物的采集选择无雨、雾、露的上午9:00—10:30。在每个群落分别取3棵不同植株个体，选定植株离地面3 m(杨树)、20～30 cm(芦苇和南荻)和4～8 cm(苔草)高度的东、西南和西北3个方向的叶片，戴上无菌手套平均采摘3个完整、无病虫害斑点的叶片，用1×PBS Buffer(Coolaber, China)浸泡固定，置于4 ℃条件下保存，带回实验室后储存于-20 ℃冰箱。

1.2 叶片微生物DNA提取

将收集的样品于室温条件下在摇床上振荡30 min(200 r·min-1)，使微生物细胞从叶片表面脱落。在无菌环境中使用真空抽滤装置将振荡液中的微生物收集到0.22 μm孔径滤膜上，使用Fast DNA spin kit试剂盒(Qbiogene, Irvine, USA)提取滤膜上的总DNA，将提取到的总DNA溶解于100 μL的dd H2O，于-20 ℃条件下低温保存。

1.3 16S rRNA/ITS基因的高通量测序

利用Illumina Hiseq测序平台分别对15个样品的细菌16S rRNA基因的V4区和真菌ITS1 rDNA基因的ITS1区进行测序，细菌和真菌的测序总样本数为30个。扩增细菌引物为515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT -3′[19]。真菌引物为 ITS5F：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；ITS1R：TGCGTTCTTCATCGATGC[20]。将扩增产物用琼脂糖凝胶(1.8 g·L-1)电泳检测纯化效果，测定纯化后产物浓度，将纯化产物等摩尔数混合，以备上机前纯化和测序仪分析用。

1.4 注释与分析

利用QIIME软件(v 1.8.0)对下机后的原始数据进行序列过滤，筛除叶绿体来源和线粒体来源的序列，以保证分析结果的准确性。利用Mothur软件去除嵌合体序列获得有效序列，以备后续分析用。通过QIIME软件的UCLUST工具，对获得的有效序列按照序列相似度(97%)进行OTU(operational taxonomic unit)划分和聚类，结合环境微生物数据库UNITE(https:∥unite.ut.ee/)、Silva(Release128/132， http:∥www.arb-silva.de)和RDP(V16， http:∥rdp.cme.msu.edu/)注释获得每个OTU所对应的分类学信息[21-23]。

α、β及谱系多样性基于OTU进行计算。α多样性通常指一个群落内物种数和每个物种的数量及分布，如物种丰富度和Shannon指数，以及随着测序技术发展出的Chao1指数和谱系多样性；β多样性用于度量在地区尺度上物种组成沿着某个梯度方向从一个群落到另一个群落的变化率[24]。笔者研究中α多样性分析参数包括物种丰富度、Chao1指数和Shannon指数及谱系多样性，Chao1指数用于通过观测数据推算理论的物种丰富度，包含未观测到的丰富度，该参数对稀有物种较为敏感[25]；谱系多样性基于系统发育树进行计算，将某一个样品中的所有代表序列的枝长加和，得到数值。β多样性采用Bray-Curtis相异矩阵和UniFrac距离进行计算，用于分析微生物群落的波动性及比较群落间β多样性。在上述参数中，数值越大，表示对应的群落多样性就越高。

不同植物群落细菌、真菌组成差异通过Bray-Curtis相异矩阵进行主成分分析(principal component analysis，PCA)。此外，多个分组之间及内部的比较采用LDA Effect Size分析(Lefse)[26]，获得组间在丰度上有显著差异的物种(biomarker)，然后，通过线性判别分析(linear discriminant analysis，LDA)对数据进行降维并计算差异显著物种的影响力(LDA score)，初设阈值为3。

2 结果与分析

2.1 洞庭湖湿地生态恢复过程中典型植物叶际细菌群落多样性

2.1.1细菌群落的α多样性

测序结果表明CK、LW、ND、TC和YS 5个群落细菌测序获得的有效序列分别为162 599、147 951、119 792、77 932和97 393条，经过处理后获得的OTU数量分别为298、337、210、125和173条。LW的OTU数量最多，其次是CK，TC数量最少。所有植物群落叶际细菌OTU共注释到334属56种，其中，LW群落获得的注释最多。不同植物群落叶际细菌多样性比较见图1，5个植物群落Chao1指数、物种丰富度和谱系多样性分布较为相似。在5个植物群落中，TC-CK、YS-CK、TC-LW和YS-LW物种丰富度之间存在显著性差异(P<0.05)；两两之间的Shannon指数均存在显著差异，5个群落Shannon指数由大到小依次为YS、TC、LW、CK和ND，YS群落Shannon指数最高，ND群落最低；5个群落谱系多样性没有显著差异。CK叶际细菌多样性参数与新生芦苇无显著差异，说明芦苇叶际细菌群落多样性较为稳定，受环境影响较小；CK与ND叶际细菌多样性无显著差异，说明两者叶际细菌群落较为相似，同时，CK叶际细菌Shannon多样性显著低于TC，但Chao1指数高于TC；此外，YS是乔木树种，其叶际细菌Shannon多样性显著高于其他草本群落，但其Chao1多样性要低于芦苇，研究结果表明芦苇叶际中可能还存在部分未观测到的细菌种类及稀有物种。

2.1.2细菌群落的β多样性与物种组成

不同群落间细菌β多样性结果〔图2(a)〕表明，YS群落细菌β多样性显著高于其他一年生草本植物群落，而其他4个群落之间差异不显著。基于Bray-Curtis矩阵对不同群落细菌组成差异进行PCA分析〔图2(b)〕，发现前两个轴共解释总变量的73.69%，其中，PC1和PC2分别解释总变量的48.44%和25.25%。从各群落的排序来看，每个群落的生物学重复相互聚集，表明重复性较好，且群落间差异明显。从PC1轴来看，YS叶际细菌群落的组成与其他群落差异较大，而其他草本群落结构较为相似。

A为物种丰富度；B为Chao1指数；C为Shannon指数；D为谱系多样性指数。*表示在0.05水平上显著，箱型图从上沿到下沿分别表示数据的最大值、上四分位数、中位数、下四分位数和最小值。YS、TC、LW、CK和ND分别为杨树、苔草、新生芦苇、原生芦苇和南荻群落。图1 细菌多样性指数箱型图Fig.1 Box plot of bacterial diversity index

细菌OTU注释结果〔图2(c)〕表明，在所有植物群落中细菌丰度较高门纲类分别为γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、芽孢杆菌纲(Bacilli)和丹毒丝菌纲(Erysipelotrichia)，其中，YS、TC、LW、CK和ND群落中γ-变形菌纲丰度占比分别为14.21%、48.99%、71.93%、88.30%和90.20%。从细菌群落组成来看，原生的CK群落与新生的ND群落更加接近，其次是新生的LW群落，表明新生的芦苇群落叶际细菌处在对环境的适应过程中。由于生态位差异，乔本的YS叶际细菌群落与草本群落的差异较大。由图2(d)可知，乔本的YS与其他草本群落差异加大，YS丰富度最高的为Allobaculum(22.57%)，其他草本群落间优势属较为相似，而TC、LW、ND均以微小杆菌属(Exiguobacterium)为主导属，丰度分别为40.66%、20.26%和7.40%，CK以泛菌属(Pantoea)、微小杆菌属和克雷伯氏菌属(Klebsiella)为主。丰度聚类结果表明，在该地区生态系统的叶际微生物中，细菌中的大肠杆菌-志贺菌(Escherichia-Shigella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、泛菌属(Pantoea)、克雷伯氏菌属、微小杆菌属丰度较高且分布相似，为叶际细菌群落的主要类别。

2.2 洞庭湖湿地生态恢复过程中典型植物叶际真菌群落多样性

2.2.1真菌群落α多样性

CK、LW、ND、TC和YS这5个类群真菌测序获得有效序列数量分别为94 090、65 577、127 167、88 037 和124 243条，处理后获得的OTU数量分别为289、253、303、205和227条。ND群落OTU数量最多，其次是CK，TC群落最低。所有植物群落叶际真菌OTU共注释到285属544种，其中，CK获得的注释最多。不同植物群落叶际真菌多样性比较见图3，5个植物群落Chao1指数和物种丰富度差异不显著；原生芦苇与新生芦苇叶际真菌多样性无显著差异；ND群落Shannon指数显著高于其他4个群落，其谱系多样性显著高于LW、TC和YS群落。研究结果表明芦苇叶际真菌群落较稳定，受环境影响较小，新生ND群落多样性较高；此外，YS叶际真菌多样性低于ND，但与LW、CK和TC群落没有差异。

YS、TC、LW、CK和ND分别为杨树、苔草、新生芦苇、原生芦苇和南荻群落。图2 叶际细菌群落的多样性结构Fig.2 Diversity structure of phyllosphere bacterial community

2.2.2真菌群落β多样性与物种组成

不同群落间真菌β多样性结果〔图4(a)〕表明，CK与LW及其他草本群落无显著差异，YS群落真菌β多样性显著低于TC和ND群落。PCA分析结果〔图4(b)〕表明，前两个轴共解释总变量的57.54%，其中，PC1和PC2分别解释总变量的32.28%和25.26%。从各群落的排序来看，每个群落的生物学重复相互聚集，表明重复性较好，且群落间差异明显。从排序结果来看，CK、LW和TC叶际真菌群落结构较为相似，而与ND和YS差异较大；从PC1来看，YS与其他草本群落的组成差异较大。

真菌OTU注释结果〔图4(c)〕表明，叶际真菌相对丰度最大的是座囊菌纲(Dothideomycetes)，其在YS、TC、LW、CK、ND中的丰度分别为31.40%、40.98%、51.60%、44.38%和26.57%；其次是粪壳菌纲(Sordariomycetes)，其在各群落的相对丰度分别为9.97%、19.07%、13.26%、6.47%和8.56%。此外，由于叶际真菌注释信息有限，可得到的物种类型相对很少，仍然存在较多未注释到的物种。真菌属级丰度热图〔图2(d)〕表明，YS真菌组成与其他类群相比差异较大，其丰度最高的为柱隔孢属(Ramularia，12.51%)，而TC、LW中镰刀菌属(Fusarium)丰度最高，分别为10.34%和7.63%，CK以隐球菌属(Cryptococcus)丰度(2.85%)为最高，ND以枝孢菌(Saitozyma)丰度(22.06%)为最高；CK真菌组成与LW、TC和ND也有一定差异，其优势群落隐球菌属、小球腔菌属(Leptosphaeria)和黑酵母菌(Aureobasidium)丰度在其他草本群落中较低，表明新生的植物叶际真菌群落还在适应环境。

A为物种丰富度，B为Chao1指数，C为Shannon指数，D为谱系多样性指数。*表示在0.05水平上显著，箱型图从上沿到下沿分别表示数据的最大值、上四分位数、中位数、下四分位数和最小值。YS、TC、LW、CK和ND分别为杨树、苔草、新生芦苇、原生芦苇和南荻群落。图3 真菌多样性指数箱型图Fig.3 Box plot of fungus diversity index

丰度聚类结果表明，在该地区生态系统的叶际中，真菌中的镶刀菌属、青霉属、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、Papiliotrema、枝顶孢属(Acremonium)和弯孢属(Curvularia)丰度较高且分布相似，是叶际真菌群落的主要类别。

2.3 植物群落间叶际微生物组成差异

Venn图展示了不同植物群落叶际微生物群落共有或特有的OTU，展示了各植物群落间叶际微生物群落结构的相似性、重叠情况及特异性(图5)。由图5可知，5个植物群落叶际细菌群落共有OTU数量为42，而YS、TC、LW、CK和ND叶际细菌群落特有的OTU数量分别为204、104、176、212和75； 5个叶际真菌群落共有OTU数量为105，而YS、TC、LW、CK和ND叶际真菌群落特有的OTU个数分别为179、37、75、112和113。5个群落叶际微生物群落中共有真菌种类高于细菌，YS和CK细菌及真菌的特有种数量较高，其中，CK细菌和真菌的特有种数量均高于LW，表明原生芦苇和杨树群落具有适应性更强的特有微生物。

YS、TC、LW、CK和ND分别为杨树、苔草、新生芦苇、原生芦苇和南荻群落。图5 细菌和真菌OTU组成维恩图Fig.5 Venn diagram of OTU composition of bacteria and fungi

不同植物群落叶际细菌和真菌群落的差异物种特征，对评价物种与叶际微生物多样性的关系十分重要，Lefse分析常用于反映某个植物群落中具有显著差异的微生物类别。不同植物群落的叶际细菌差异见图6(a)，YS中鉴定到的有显著差异的微生物种类有5属8科3种；TC中鉴定到的有显著差异的有8属10科3种；ND有2属4科1种；LW有5属10科1种；CK有7属8科，OTU中具有显著差异的全部未注释到物种。

不同植物群落的叶际真菌差异见图6(b)，YS中鉴定到的有显著差异的微生物种类有5属5科7种；TC有3属3科3种；ND有5属6科6种；LW有4属4科3种；CK有5属7科8种。

3 讨论

洞庭湖杨树清理对该区域生态系统产生较大影响，其中，最直观的就是植物多样性。刘静逸等[27]研究发现，洞庭湖杨树清理后，土壤种子库萌发物种数、种子库密度和物种多样性指数显著高于未清理的杨树样地，湿地恢复潜力增强；在自然恢复过程中杨树清理迹地土壤酶活性显著增强，土壤含水率和土壤氮、磷、钾以及有机质等含量较杨树样地明显提高，为其他植物定植提供了条件；杨树清理后，随着水淹频次的增加，一或二年生湿生物种迅速减少，芦苇、南荻以及多年生物种所占比例增加，水文波动驱动了清理迹地的群落演替。随着植物多样性结构发生改变，生态系统中微生物多样性也在变化。植物叶片栖息了大量细菌、酵母、丝状真菌、藻类等微生物群落，在某些情况下，还生活着线虫和原生动物[28]。大量研究表明，目前已经探明的叶际微生物种类只涵盖了很少一部分，自然界仍存在大量未知叶际微生物，例如对巴西热带雨林不同物种叶际细菌群落的研究表明，97%的细菌序列来自未知物种，而能够获得注释的物种数从95到671个不等[29]，自然界中存在大量未培养和未鉴定的微生物[30]。此次研究从5种植物类群中鉴定到的细菌和真菌OTU平均分别超过10万个，但分别仅有56和544个为已知物种，表明在洞庭湖湿地叶际生态系统中仍存在大量未知微生物种类。

一般来说，叶际细菌中主要类群为好氧细菌类群，此次研究中主导细菌类群主要为兼性厌氧类群，如类芽孢杆菌属、泛菌属和克雷伯氏菌属等，一方面这与湿地植物周期性水淹造成无氧环境有关；另一方面与叶际微生物来源有关，例如沉降、雨水溅射和土壤污染也会导致环境尤其是土壤中厌氧微生物迁移到叶片上[31]。笔者研究中植物群落叶际真菌主要为座囊菌纲(Dothideomycetes)和粪壳菌纲(Sordariomycetes)，与之前报道的水葱(Schoenoplectustabernaemontani)、芦苇等湿地植物一致[32-33]，其主导类别除了常见的短梗霉属(Aureobasidium)、镶刀菌属(Fusarium)、青霉属(Penicillium)外[34]，还有弯孢属(Curvularia)等，但目前普遍认为上述类丝状真菌通常以孢子形式存在，只是叶际中暂时的定居者。

叶际微生物生存环境十分恶劣，主要是由于叶际的理化条件较为特殊，例如，叶表环境温湿度波动较大，紫外辐射较强，叶表面的营养物质十分有限，再加上不同植物种类、不同发育阶段的差异，导致叶际微生物为了适应环境而演化出复杂的群落特征，并提供了宝贵的强耐受性基因资源[35]。

图中由内到外的圆形代表由界至种的分类级别，在不同分类级别上的每一个小圆圈代表该分类水平下的一个物种，其直径大小与相对丰度呈正比，黄色圆圈表示无显著差异的类别。YS、TC、LW、CK和ND分别为杨树、苔草、新生芦苇、原生芦苇和南荻群落。图6 植物群落间叶际微生物组成差异分析Fig.6 Analysis on the difference of phyllosphere microbial composition between plant communities

笔者研究中，5个植物群落叶际微生物群落结构差异较大，定殖的微生物群落也有较大差异，尤其是天然更新的杨树群落的组成和多样性与其他草本群落差异显著，其原因可能是杨树高度高于其他草本而导致其局部气候的差异。同时，杨树叶片的结构，例如气孔、叶表皮细胞、网状脉等不同于其他草本植被。此外，原生芦苇群落叶际无论是细菌还是真菌群落，虽然α多样性与新生芦苇及其他草本植物较为相近，但其在组成上确有较大差异。原生芦苇群落的优势菌群与其他植物群落存在一定区别，并且原生芦苇和杨树群落都具有更多特异性微生物，这表明原生植物在定殖后逐渐改变多样性结构以适应新的环境，因此，新生芦苇与原生芦苇群落叶际多样性结构差异较大。此外，不同植物群落间微生物与宿主之间存在不同的互作关系，例如，天然更新的杨树和薹草叶际微生物中假单胞菌(Pseudomonasspp.)占比高于其他植物群落，而该属细菌约一半的菌种能够产生表面活性剂来增加叶面湿润度，从而改变叶际水分利用环境[36]；在苔草和芦苇(原生及次生)群落中发现了正固氮螺菌(Azospirillum)，该类菌属能够利用叶际产生的营养和能量发挥固氮作用[37]，从而促进植物发育和生态系统的固氮功能。此外，甲基杆菌属(Methylobacterium)作为叶际微生物中最常见的兼性甲基营养菌类，其代谢物通常具有抗植物病害的作用，在农业领域应用较多[38]，笔者研究中所有植物叶际均发现该类细菌，但其在芦苇中的丰度远高于其他植物〔图6(a)〕，表明芦苇可能具有更强的病虫害抗性。

植物的环境、物理化学和遗传特征决定了微生物生存和生长的能力[39]，并且人类的实践活动对微生物的定殖也有很大影响[32]。对于洞庭湖杨树清理迹地，人为干预后的人为/天然更新植物群落不仅提升了区域植物多样性，而且增加了叶际微生物多样性，这些额外定殖的微生物在某些方面提升了区域生态系统的生态功能，如固氮、抗病等，表明洞庭湖杨树清理和迹地生态修复对于洞庭湖湿地生态系统功能的提升起到了促进作用。

4 结论

叶际微生物作为生态系统中重要的组成部分，具有不可忽视的生态功能。对洞庭湖杨树清理迹地主要植物群落叶际微生物细菌和真菌群落结构的分析结果表明，乔木杨树叶际细菌多样性最高，细菌和真菌多样性组成与草本植物差异较大，且具有较多特异性微生物种类。草本群落间微生物多样性结构差异较大，且新生芦苇群落与原生芦苇群落叶际微生物也具有一定差异，表明叶际微生物群落在定殖过程中会改变多样性结构来适应环境。研究表明区域植被群落的增加不仅提升了植被多样性，而且提供了叶际环境的多样性，从而为许多有益叶际微生物提供栖息地。该研究不仅分析了不同植物种类叶际微生物组成差异，也为探索洞庭湖杨树清理迹地生态系统功能恢复提供了理论支撑。