烘烤期烟叶霉烂病病原菌Rhizopus oryzae的生态学研究

朱自萍，何鹏飞，刘迎龙，赵正龙，吴毅歆，何鹏搏，蔡永占，MUNIR Shahzad，田阳阳，王军伟，何月秋

（1云南农业大学，昆明 650201；2云南省烟草公司曲靖市公司，云南 曲靖 655000；3红塔烟草（集团）有限责任公司，云南 玉溪 653100）

0 引言

米根霉(Rhizopus oryzae)是一种丝状真菌，主要产乳酸，长期以来用于生产酶制剂，有机酸和各种发酵食品[1]。它常见于土壤，腐植物体，也是热带果蔬采后主要病原菌之一，不仅引起果实腐烂，影响果实风味，还能分泌对人体有毒害作用的麦角类生物碱，对果蔬贮藏具有极大的危害[2]。如引起马铃薯块茎[3]、苹果[4]、香蕉[5]的果实等软腐病，轮叶党参采后根腐病[6]，初烤烟叶的叶片和茎杆[7]发生腐烂，影响产品质量。近年来，云南、四川、贵州、广西、福建等国内部分烟区烘烤期烟叶霉烂病频发，已成为烘烤损失的主要原因[8-9]。虽有报道烘烤期烟叶霉烂病病原青霉属(Pencillium)和曲霉属(Aspergillus)真菌为优势种群[10]，但国内不同烟区发现烘烤期烟叶霉烂病的主要病原菌是米根霉(Rhizopus oryzae)[11-12]。在烤烟房内发病时，叶柄处首先出现水渍状斑，变褐腐烂，病部缢缩软化，随后再由基部沿叶脉向叶片尖端延伸，表面着生大量白色菌丝，后期菌丝体变为灰黑色，最终导致叶片大面积发霉腐烂[11]。然而，关于烘烤期烟叶霉烂病的研究报道并不多，病原菌米根霉在田间条件下生存场所、分布规律，及与烘烤过程中的病情关系仍不清楚。因此，本研究针对米根霉生态学开展调查和探索性试验，以期为制订烘烤期烟叶霉烂病的防控策略提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株、培养条件及其他材料

米根霉Rhi-1(Rhizopus oryzae Rhi-1)由本实验室保存。马铃薯蔗糖琼脂(PSA)培养基用于米根霉的培养，加了10 mg/mL氨苄青霉素和10 mg/mL利福平的PSA用于从土壤中分离根霉菌。

‘云烟87’的叶柄由云南省烟草公司曲靖市公司提供，其茎杆采自玉溪市连年种植的烟区和第一次种植的烟区。作物根围土样采自云南省玉溪市和安宁市。

1.2 方法

1.2.1 烟草根围根霉菌分离与致病性鉴定 从土壤样本中分离根霉菌。在加入氨苄青霉素和利福平的PSA培养基中，以梯度稀释法，分离根霉菌。在PSA板上纯化1次后，接种到装有50 mL液体PSA培养基的250 mL三角瓶内，28℃，160 r/min振荡培养3～4天。无菌双层纱布过滤，血球计数板测定其孢子液浓度，通过加无菌水将浓度调至1×105cfu/mL，备用。

用无菌刀具将烟草叶柄切成2.0 cm左右的块状组织，置于75%酒精浸泡1 min，无菌水漂洗3次，再用无菌吸水纸吸干表面残余水分。将消毒后的叶柄移入底部铺有湿润无菌滤纸的9.0培养皿，向叶柄切口处滴加50 μL的1×105cfu/mL孢子悬浮液，验证分离菌株的致病性。接种后，全部培养皿移入37℃恒温培养箱保湿。2天后观察叶柄发病情况，以米根霉Rhi-1和无菌水分别为正对照和负对照，每个处理含有30份烟草叶柄块，重复3次。

1.2.2 根霉菌在田间烟草叶柄和茎杆中的分布 用消毒刀具将田间烟草叶柄自基部向尖部切成4段（各2 cm），分别命名为Fir、Sec、Thr及For，各处理30段，无菌镊子夹取放入底部铺有湿润无菌滤纸的9.0培养皿内，最后一同移入37℃恒温培养箱保湿培养。2天后观察霉烂病发生情况并统计各段叶柄的发病数量，重复3次。

仿1.2.1操作将烟叶柄基部切成长度为2 cm的组织，分别按如下处理：(i)不消毒，直接在烟柄切口滴加50 μL米根霉Rhi-1孢子悬浮液；(ii)75%酒精表面消毒1 min，灭菌水清水3次后，不接种孢子悬浮液；(iii)75%酒精表面消毒1 min，灭菌水清水3次后，在烟柄切口处接种50 μL米根霉Rhi-1孢子悬浮液；(iv)烟柄不做任何处理。随后37℃恒温培养箱保湿培养。2天后观察霉烂病发生情况并统计各段叶柄的发病数量。每个处理含30个烟草叶柄，重复3次。

取‘云烟87’成株期烟草茎杆35株，自叶柄处截成25小段，距根系最近处的茎节为第1段，依次排序至第25段；纵剖各节，用消毒刀挖取含有芽眼的部分茎节组织（0.5×1.0 cm，含皮层、木质部及髓部），直接转移到含有氨苄青霉素和利福平的PSA平板内，37℃恒温培养箱培养2天，观察及统计茎节组织有无米根霉生长情况。

1.2.3 烟草霉烂病与叶柄含水量测定 仿1.2.1操作制备块状叶柄组织（约2 cm）并表面消毒，无菌吸水纸吸干叶柄组织表面残留水分放入培养皿中，再用37℃烘箱分别烘烤1、2、3、4、5、6、7、8、9及10 h后，称重(W1)，获得不同含水量的叶柄组织。每个时间段30个烟柄为1重复，重复3次，共900个烟柄。随后在叶柄组织切口中央接种50 μL米根霉Rhi-1的孢子悬浮液，保鲜膜封住培养皿上口，37℃恒温培养箱培养。2天后，观察有无米根霉生长，统计发病情况后放入37℃烘箱烘烤直至恒重，再次称重(W2)。2次叶柄逐个地分开称重。将不同含水量分组，统计其与发病率的关系。发病率的计算见公式(1)，按公式(2)计算烟草叶柄含水量，探究含水量与霉烂病发病率之间的关联性。

其中0.05为50 μL米根霉孢子悬液。

1.2.4 根霉菌在不同作物根围土壤中的含量测定 土壤样品采集。（1）分别从烟草连作烟田和新植烟田（首次种植）的健康和因黑胫病致死的烟草植株根围采集土壤，及烟草连作毗邻的种植有生姜或玉米的根围处取土；（2）在烟草黑胫病发生严重田块，分别从距离病死亡的烟株10、20、30、40 cm处；（3）在烟草后茬作物西葫芦、玉米、苦荞、花菜、豌豆、蚕豆、芋头地块，采集作物根围土壤。其中在安宁市青龙镇只采用首次植烟的根围土（红壤），包括烟草在内作物根围土均采自新平县甸乡朵舍宗村。各作物取3个同类型地块，每块地随机5点取样，构成一个混合样，1个重复。土壤采集后，密封袋封存，室温储存备用。

土壤中根霉菌含量测定。从密封袋中取出部分土壤样品，自然风干。随后取5 g土样加入装有45 mL无菌水的250 mL三角瓶中，30℃，120 r/min振摇1 h，室温静置0.5 h，即为10-1土壤稀释液。取5 mL上述稀释液至另一装入45 mL无菌水的三角瓶内，充分振摇，即为10-2稀释液。如此反复，制备出10倍梯度系列稀释液。分别吸取10-1、10-2及10-3稀释液100 μL转移至含有氨苄青霉素和利福平的PSA平板内，均匀涂布，37℃培养箱培养20～22 h，最后根据米根霉菌菌落数，测算出根霉菌在相应土壤中的含量，各处理重复3次。

1.2.5 数据分析 利用SPSS 18.0软件中的单因素方差分析(one-way ANOVA)比较各处理数据的差异性，所有数据结果均以平均值±标准差(±SD)的形式表示。

2 结果与分析

2.1 烟草根围根霉菌对烟草叶柄的致病性

从烟草根围土壤中分离到的根霉主要有米根霉(R.oryzae)和小孢根霉(R.microsporus)。两者菌落最初白色，后变为灰褐色或黑褐色。菌丝匍匐，菌丝体发达，孢子囊黑色。前者菌落疏松，后者菌落稠密，作为2个种的鉴别性特征。挑取土壤中米根霉显微观察，它能产生典型球囊状结构，孢囊孢子无色圆球形，符合根霉菌的既有描述，也与Rhi-1形态高度相似（图1A和B），分子鉴定它们亦属米根霉。在接种的烟草叶柄组织块上，所有叶柄周身密被白色发达气生菌丝体，切口处尤盛，与对照Rhi-1菌株接种的病征相似（图1C和D），证明从菌落形态上判断烟草根围土壤中的米根霉是正确的。

图1 烟草根围根霉与米根霉Rhi-1的形态及对烟草叶柄的致病性

2.2 米根霉在田间烟草叶柄和茎节处的分布规律

2.2.1 叶柄处 将切段的烟草叶柄块状组织置于保湿的培养皿中，直接放入37℃培养箱培养，2天后检查发病情况。自然发病越靠近茎杆的烟草叶柄发病越重：距离茎杆最近的第一段(Fir)块状叶柄长出根霉的有7.33个(a)，第二段（Sec）3.67个(ab)、第三段(Thr)2.00个(ab)以及距离叶柄基部最远的第四段(For)1.67个(b)（括号后的字母表示在P≤0.05水平下差异显著性，下同），表明米根霉主要在近茎杆的叶柄组织中存活。

为探究米根霉是否来自茎杆，采用75%酒精消毒叶柄后做4个不同处理，结果（表1）表明，未处理的叶柄发病率为21.11%；酒精消毒不接米根霉的叶柄未发病；不消毒接种米根霉的发病率达到67.76%；表面消毒后，接种根霉的叶柄发病数量最多，平均达28.33个，占94.44%，其中原因可能与同一环境内的拮抗微生物在表面消毒阶段被酒精大量杀灭以及叶柄细胞抗性相关酶被酒精钝化而无法有效地抑制后续的根霉侵染有关。

表1 表面消毒和米根霉Rhi-1接种对叶柄霉烂病发生的影响

2.2.2 节间处 基于上述试验结果，切取不同类型烟田烟株茎杆叶柄着生处，采用组织分离法研究米根霉在烟株茎杆中的分布。结果显示连作烟田中烟杆叶柄着生处的米根霉含量均高于新植烟田，带米根霉的茎节组织最高分离记录来自连作田烟株的第14个叶柄着生组织，为18个（占51.43%），最少为0个（首种烟田烟株第25个叶柄着生组织），表明米根霉在连作烟区烟株茎杆中的菌量多于新植烟田。无论连作烟田还是新植烟田，米根霉多聚集在烟草茎杆中下部（第1～14节）叶柄着生处，高于上部茎节组织（图2）。

图2 携带根霉数量与烟草茎节序数之间的关系

2.3 烟草叶柄霉烂与叶柄组织含水分量的关系

在烟草叶柄不同含水量的条件下，接种米根霉Rhi-1菌株。结果表明（图3），当叶柄的含水量在80.00%～89.99%与90.00%～95.74%之间时，霉烂病发生较为严重，发病率分别为57.14%、50.33%，与50.00%～60.99%含水量的42.21%发病率没有显著差异；其中以70.00%～79.99%的处理组病害发生最为严重，发病率高达68.20%，含水量为50.99%以下的各试验组没有显著差异，但烟叶霉烂病的发生率极显著地下降，当含水量低于39.99%时，烟草叶柄完全没有发病。

图3 叶柄含水量与霉烂病发病关系

2.4 根霉在不同类型作物根围土中的分布规律

从连作烟田和新植烟田或其毗邻田的烟草或其他作物植株根围取土，稀释分离米根霉菌的结果表明（图4），同块烟田里健康烟株根围处米根霉含量明显少于烟草病株，而显著高于新植烟田的根围土中的数量。因烟草黑胫病而死亡的烟草植株根围土中米根霉含量最为丰富，达103CFU/g，高出同一田块健康烟株2倍，这可能与植株因死亡而丧失抗病能力有关，也暗示田间烟草病死株是弱寄生根霉菌的良好培养基。种植玉米或生姜的田块虽与烟田毗邻，但其根围处的根霉含量明显少于烟田烟株，尤以生姜最为明显。

图4 田间不同作物根围土中的根霉数量

2.5 米根霉与烟草黑胫病病株距离间的关系

在距离田间表现出典型黑胫病症状的烟株10、20、30、40 cm处采集地下20 cm上的土壤，稀释分离米根霉。米根霉在土壤中分布不均匀，距离烟株越近的土壤含量越多。距离烟株10、20、30、40 cm，米根霉菌量分为433.33 CFU/g(a)、118.52 CFU/g(b)、74.07 CFU/g(b)、111.11 CFU/g(b)，其中距离烟株10 cm处土壤中的含量最高，分别为距烟株20、30、40 cm的3.7倍、5.9倍和3.9倍，但20、30、40 cm间米根霉菌数量差异未达显著水平。

2.6 米根霉在烟田后茬作物根围土中的数量

从烟草后茬作物玉米、花菜、豌豆、苦荞、西葫芦、芋头、蚕豆的根围土中分离米根霉菌的结果表明（表2），后茬作物对根围土中米根霉菌有重要影响，其中西葫芦根围土内的米根霉数量最高，达1466.67 CFU/g，与上述试验中的烟草黑胫病烟株测定结果（图4）相近，高于连作田和新植田烟草植株根围土的米根霉数量。其次是花菜和苦荞根围米根霉菌量达1055.56 CFU/g和994.44 CFU/g。芋头根围(677.78CFU/g)土中的米根霉菌数量与烟草(662.22 CFU/g)的相当，相反，种植玉米、豌豆或蚕豆，其根围土内的米根霉数量较少，尤以豌豆和蚕豆最为明显，它们的根围土中米根霉数量分别为244.44 CFU/g和33.33 CFU/g。

表2 烟草后茬作物根围土壤中米根霉菌数量

3 讨论

烘烤期间烟叶霉烂病是烟叶烘烤过程中一种严重的病害，关于其病原物有多种认识[13]。据笔者的前期研究，米根霉是烟叶烘烤阶段霉烂病发生的主要病原[11-12]。本研究发现米根霉分布在田间烟草叶柄、茎杆与叶片分枝交界处，从田间随机采集的叶柄自然发病率为21.11%。值得注意的是，根霉菌在烟草叶柄、烟草茎节处以及根围土壤中并非均匀分布，优先栖生于靠近茎杆的叶柄、中下部茎节以及毗邻主根的根围土壤。根霉菌偏好在这些位置生活，可能与这些位置特定的形态结构或生理生化特点有关。叶柄基部与茎杆形成一定角度的区域，水易于滞留，保持湿润时间长于其他区域；同时，此部分也是光合作用产物、水和无机矿物质运输分流的重要枢纽，营养物质丰富程度较高，这些特点吸引根霉菌定殖，病原菌易着生和萌发侵入。根系分泌物向外输送存在渗透效能：越靠近根系，分泌物浓度越高，微生物种类及数量也越多。PRIKYL等[14]的研究指出，根系分泌物的数量与微生物存在密切关系。本研究发现距离主根40 cm的土壤内米根霉数量明显低于距离主根10 cm的，表明该病原菌具有寄主营养依赖的特性。

根霉菌是一类弱寄生真菌，田间环境下难以看到此类真菌引起的病害。究其原因除了腐生性强外，还可能与其侵染活动容易受不良因子如拮抗微生物的影响有关，如未作表面消毒和做过消毒处理的叶柄，接种米根霉后，前者发生率(67.76%)显著地较后者(94.44%)轻，这可能与消毒后清除了叶柄处的其他拮抗微生物的影响，或者酒精处理钝化了抗性相关酶的活性有关。因此，在接种时，应该考虑到表面消毒过程对接种结果的影响，适当地缩短消毒时间。

本研究表明米根霉多聚集在烟草茎杆中下部叶柄，这与李生栋等[15]烤后烟叶霉烂病发病率和病情指数随烟叶部位的升高而减小相符。根霉菌的弱寄生特性还可在寄主植物烟草成熟衰老（抗病性下降）的中下部茎节处以及患有烟草黑胫病的烟草植株根围土壤含量最高，烤房中感染烟草黑胫病的叶片易感染烟叶霉烂病的现象中得到印证。连作烟田烟草植株根围土内根霉菌含量普遍高于新植烟田，可能与连作烟田内烟草病株残体较多有关。由此看来，及时清除田间的病株残体，减少病原物的越冬、越夏场所对烘烤期烟叶霉烂病可能有所作用。同一地区相邻生姜田和玉米地根围土米根霉数量显著低于烟草连作田，烟草采收后种植豆科作物豌豆和蚕豆可有效地抑制根霉菌在烟草根围环境中的生存，相反种植西葫芦、花椰菜、苦荞则促进根霉菌定殖。这可能与后期作物根系分泌物影响到烟株根围微生物数量和种类，从而对烟草根围米根霉数量造成影响有关，不同植物根系分泌物的主要成分不同，造成不同植物根系土壤周围的微生物类群不同[16]。因此，改进耕作制度和合理搭配作物可能对减轻烘烤期间烟叶霉烂病防治具有积极作用。在烤房中，烟草霉烂病至42℃时仍能发病，随着烤房中温度的升高，烘烤期间烟叶霉烂病的发病速度逐渐减慢至停止，但是霉烂病的病原菌孢子能在44.6℃萌发，菌丝体在低于70℃下仍能存活[11]，表明烤房中的湿度可能是烟草烘烤期烟叶霉烂病发病的限制因子。本研究通过预先设置不同含水量的烟叶柄，再接种病菌孢子悬浮液，证明烟叶含水量70.00%～95.74%时霉烂病发生严重，最适的湿度范围在70.00%～79.99%之间，即米根霉发病的温度范围较广，但在烘烤中后期病情停止发展的原因是由于烟叶含水量不足所引起。烤房内烟叶变黄期温度为32℃～42℃，定色期43℃～54℃，干筋阶段65℃～68℃[17]。变黄期烤房内的温度达32℃～39℃，相对湿度达75%～85%时，有利于米根霉繁殖和侵染，是烘烤期间烟叶霉烂病的主要发生时期[18]，与本试验结果基本相符。

本研究对引起烘烤期间烟草霉烂病的病原菌米根霉的部分生态学进行了研究，明确了田间叶柄带菌，且中下部叶柄带菌量多于上部叶，烟草连作烟田根围土中米根霉菌量大于新植烟田，蚕豆和豌豆根围土中菌量低于西葫芦、花椰菜根围土中的菌量，这对烟草霉烂病防控措施前移将有指导意义。然而，土壤中的病菌如何进入烟草植株？有待下一步深入研究。