伊犁河谷西天山野果林苹果巢蛾重要寄生性天敌资源调查*

席欧彦 朱 丹 钟 问 王晨日 胡红英

(新疆大学生命科学与技术学院 新疆生物资源基因工程重点实验室 乌鲁木齐 830046)

苹果巢蛾(Yponomeutapadella)属于鳞翅目(Lepidoptera)巢蛾科(Yponomeutidae)巢蛾属(Yponomeuta)，是欧洲巢蛾复合体(Yponomeutapadellacomplex)中的成员之一，最早在欧洲被发现(Mcdonoughetal., 1990)。目前在加拿大、美国、日本、韩国和中国等均有发生且分布广泛。在美国发现的苹果巢蛾为欧洲的入侵物种(Kuhlmannetal., 1998; Leeetal., 2005; Naetal., 2018)； 而该害虫在中国主要发生于哈尔滨、沈阳、甘肃、内蒙古和新疆等地区，1年均发生1代，危害严重(方岩， 2000； 刘寿民等， 2005； 赵连吉等， 2000)。苹果巢蛾的寄主植物主要包括苹果(Malusspp.)、山楂(Crataegusspp.)和李子(Prunusspp.)等蔷薇科(Rosaceae)植物，其幼虫对寄主植物危害最为严重，大量幼虫会在叶片和枝条上吐丝结网，许多丝网聚集在一起形成丝巢，导致叶片大量脱落，严重时更会造成树木枯萎死亡(Mowatetal.， 1995)。

伊犁河谷西天山野果林是天山野果林的重要组成部分，是现代栽培果树的发源地和重要的天然种质资源库。近年来害虫大面积爆发，导致西天山野果林森林生态系统遭到严重破坏，而苹果巢蛾的出现也成为了潜在的威胁。寄生性天敌在害虫生物防治中起到了关键性的作用，在害虫的卵期、幼虫期或蛹期就可将其致死，达到一种安全有效的生物防治效果。因此，需要选择合适的寄生性天敌来防治苹果巢蛾，减轻该害虫危害的同时保护野果林的生态平衡和生物多样性。

在生物防治中寄生性天敌起到了重要的作用。崔存俭等(1997)对内蒙古赤峰的苹果巢蛾生物学特性进行了研究，提出利用保护性天敌的生物防治和化学防治两种方法对其进行防治。哈米提等(2010)对分布在新疆额敏县的西天山野果林中的苹果巢蛾进行了探究，发现其3种寄生蜂，分别为卵到幼虫跨期寄生蜂巢蛾多胚跳小蜂，蛹期寄生蜂黄柄齿腿长尾小蜂(Monodontomerusdentipes)和幼虫到蛹跨期寄生蜂全北群瘤姬蜂指名亚种(Iseropusstercorator)，其中巢蛾多胚跳小蜂为优势种，但是对寄生蜂的详细形态特征、雌雄比和羽化过程等均未研究。欧洲对苹果巢蛾幼虫和蛹期的寄生蜂也开展了研究，结果发现姬蜂在苹果巢蛾的生物防治中具有重要的防治潜能(Kuhlmann， 1996； Unruhetal.， 2003)； 土耳其研究者对苹果巢蛾等4种巢蛾的寄生蜂进行了全面调查发现了15种寄生蜂，其中姬蜂科数目最多，茧蜂科次之，而巢蛾多胚跳小蜂在4种巢蛾中均可寄生(Narmanliogluetal.， 2017)。1987—1997年，加拿大研究者引进了来自欧洲的巢蛾多胚跳小蜂进行田间释放，统计结果表明该寄生蜂的寄生率可达23%，在一定程度上可以有效地防治苹果巢蛾(Vincentetal.， 2007)。寄生蜂作为一种重要的生物防治因子在多个国家的苹果巢蛾防治中已经取得良好的效果。因此，探究苹果巢蛾的寄生蜂资源可为苹果巢蛾的生物防治提供参考依据。

我国对苹果巢蛾寄生性天敌的研究主要是寄生蜂资源的调查，而针对新疆伊犁河谷西天山野果林苹果巢蛾寄生蜂形态鉴定和寄生生物学的研究几乎没有相关报道。因此，本研究主要针对伊犁河谷西天山野果林苹果巢蛾的寄生性天敌进行调查和分类研究，并探明其优势寄生蜂的形态特征、寄生率和发育历期，研究结果为保护西天山野果林寄生性天敌昆虫多样性，利用寄生性天敌进行苹果巢蛾的生物防治提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及仪器

1.1.1 供试虫源 根据伊犁河谷野果林的分布情况，在巩留、伊宁2个县野果林集中分布的地区设置采集样地。每个县设3块样地，样地大小为50 m×50 m。2016—2017年，在伊宁县吉尔格朗沟野果林、巩留县小莫合乡野果和巩留县大莫合乡野果林三个地点采集不同发育阶段的苹果巢蛾带回室内饲养并观察，将有卵块的叶片置于玻璃试管20 cm×3 cm，等待羽化。饲养条件为温度25～30 ℃，RH： 45%～50%，光周期14 L∶10 D。

1.1.2 试验仪器 RXZ型智能人工气候箱(宁波江南仪器厂)，SMZ25体视显微镜和SM745 T体视变焦显微镜(Nikon)； 玻璃试管、脱脂棉和培养皿等(新疆宝信源柏生物技术有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 苹果巢蛾生活史的研究 根据苹果巢蛾的生物学特性和活动时间，结合当地气象预报。于2016年对伊犁河谷西天山野果林的苹果巢蛾进行初步观察。2017年5—9月，每个月在巩留和伊宁2个县的样地进行定点调查并采集标本，每月采集共计20天左右，并在野外观察拍照记录苹果巢蛾的生活史和危害行为。

1.2.2 苹果巢蛾寄生蜂的收集与鉴定 野外收集苹果巢蛾的卵、幼虫和蛹，光照培养箱中饲养并观察，之后拍照统计数目。其中，卵块需每6 h观察1次，管内适时补充水分。幼虫每12 h观察1次，部分幼虫活性弱，不活跃，虫体表观特征异常或者发育明显晚于同龄个体则很有可能已被寄生，需对其进行针对性观察，定期计数，并解剖死亡个体。将3头蛹放入1支玻璃试管内，每6 h观察1次，并观察羽化情况，对延迟羽化或不羽化的蛹重点观察。收集羽化出的寄生蜂，按采集地、采集时间和分类阶元将寄生蜂标本保存在无水乙醇中，置于-20 ℃冰箱保存。寄生蜂标本制成针插标本或玻片标本用于分类鉴定，并利用数码体视显微镜拍照。标本均存放于新疆大学生命科学与技术学院昆虫研究室(ICXU)。

1.2.3 巢蛾多胚跳小蜂的基因组DNA提取及PCR扩增 利用基因组DNA无损伤提取方法，将待测昆虫标本整体浸入无水乙醇中，并置于-20 ℃的冰箱中至少2 h。制备100 μL体系的缓冲液： 10×PCR Buffer 10 μL、0.45% NP-40 0.5 μL、0.45% Tween-20 0.5 μL、0.6 mg·mL-1Protein K 3 μL、ddH2O 86 μL。挑取完整寄生蜂用蒸馏水清洗后，加入提前配制的缓冲液，50 ℃恒温水浴锅中孵育1 h，-20 ℃冰箱静置约17 h，95 ℃热激10 min； 将提取完成的DNA放置在-20 ℃的冰箱中保存。COI基因的PCR扩增，引物序列(J1718： GGAGGATTT GGAAATTGATTAGTTCC； N2191： CCCGGTAAAATT AAAATATAAACTTC)，扩增体系总体积为25 μL，包括2×PCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA模板5 μL、ddH2O 6.5 μL。扩增程序为： 95 ℃预变性2 min，95 ℃变性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸3 min，4 ℃保存。扩增产物用1%琼脂糖胶电泳检测并由生工生物工程(上海)有限公司进行测序。

1.2.4 优势寄生蜂巢蛾多胚跳小蜂的发育及羽化 本研究共采集获得750头苹果巢蛾幼虫和303头蛹，室内饲养并将幼虫和蛹分为两组，每天记录羽化出的寄生蜂的数目，将每头幼虫和蛹中羽化出的寄生蜂数目统计分析，计算出优势寄生蜂巢蛾多胚跳小蜂的自然寄生率。随机选取被寄生的苹果巢蛾幼虫100头分为10个组，每个组10头进行试验，观察巢蛾多胚跳小蜂的羽化全过程，每个过程拍照记录。羽化过程结束后，统计数目，对巢蛾多胚跳小蜂的雌雄比统计分析。

1.3 数据分析

采用Excel 16.0对苹果巢蛾的生活史数据统计，巢蛾多胚跳小蜂的雌雄比例统计分析采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5.0数据处理软件。

2 结果与分析

2.1 苹果巢蛾的生活史和形态特征

苹果巢蛾1年发生1代，以1龄幼虫在卵壳内越夏、越冬。幼虫在伊犁河谷4月下旬开始出壳取食叶片，到6月中旬左右为止，约45天。幼虫分为1～5龄，其中3～4龄幼虫在5月危害最为严重，6月中旬老熟幼虫不再取食，停留在网巢内吐丝结茧、陆续化蛹。成虫羽化后，短距离飞行取食，交尾产卵。7月下旬孵化出1龄幼虫在卵壳内越夏和越冬(表1)。

表1 新疆伊犁河谷西天山野果林苹果巢蛾生活史①Tab.1 Life history of Y. padella in western Tianshan mountains, Yili valley, Xinjiang

苹果巢蛾的成虫体长8～13 mm，体白色并带有银色的光泽，触角为白色丝状，胸部背面有5个黑色的点状斑。前翅白色略带有灰色光泽并有 40个左右的黑色点状斑，大致排为3列，外缘缘毛为灰褐色(图1c)。老熟幼虫体色为灰褐色，体长13.2 mm，头部单眼成“一”字形，背部有数根刚毛(图1a)； 蛹的体长为9～10 mm，分散于整个丝巢内结茧化蛹，初化蛹时，头部、触角和翅芽为黄色，胸部和腹部为红色，老熟的蛹为黑褐色，臀部具6根刺(图1b、d)。

图1 苹果巢蛾各龄期形态特征Fig. 1 Morphological characteristics of various developmental stages of Y. padellaa： 幼虫 Larve； b： 结茧化蛹Pupa； c： 成虫 Adult； d： 蛹壳 Puparium.

2.2 苹果巢蛾寄生性天敌资源

在实验室共饲养得到4种寄生蜂和1种寄蝇(表2)。其中，巢蛾多胚跳小蜂(A.fuscicollis)和选择盆地寄蝇(Bessaparallela)寄生于苹果巢蛾幼虫体内； 齿腿长尾小蜂(Monodontomerussp.)、群瘤姬蜂(Iseropussp.)和长尾啮小蜂(Apronstocetussp.)是苹果巢蛾蛹期的寄生蜂。对各寄生性天敌的种类描述如下：

表2 伊犁河谷西天山苹果巢蛾的采样点及获得寄生性天敌种类Tab.2 Species reared from Y. padella collected in Yili valley western Tianshan mountains

2.3 各寄生性天敌记述

生物学： 室内饲养野外采集的苹果巢蛾蛹，在苹果巢蛾的蛹壳上发现有长尾啮小蜂的羽化孔(图2)。其寄主范围很广，包括： 双翅目、膜翅目、鞘翅目、半翅目、同翅目和直翅目等(厉向向， 2013)。该寄生蜂为首次记录的苹果巢蛾寄生性天敌。

图2 饲养获得苹果巢蛾寄生性天敌—长尾啮小蜂Fig. 2 Rearing A. sp. from Y. padellaa： 寄主蛹 Pupa； b： 茧和蛹壳 Cocoon and puparium； c： 长尾啮小蜂蛹 Pupa of A. sp.； d： 长尾啮小蜂羽化孔 Emergencing holes of A. sp.

图3 长尾啮小蜂外部形态特征(♀)Fig. 3 Female adult of A. sp.showing external features(♀)a： 体，侧面观Body, lateral view； b： 头，正面观Head, anterior view； c： 触角Antenna； d： 前翅Forewing； e： 体，背面观Body, dorsal view.

图4 长尾啮小蜂外部形态特征()Fig. 4 Male adult of A. sp. showing external features()a： 体，背面观Body, dorsal view； b： 头，侧面观Head, lateral view； c： 中胸，背面观Pronotum, dorsal view； d： 腹部，背面观Abdomen, dorsal view.

2.3.2 齿腿长尾小蜂 标本信息： 5♀， 2017-07-05，采集于新疆伊犁地区伊宁县吉尔格朗沟野果林(海拔： 1 151 m)，室内饲养苹果巢蛾的蛹获得(图5)。

图5 齿腿长尾小蜂外部形态特征Fig. 5 Adult of M. sp.showing external featuresa： 寄生在寄主蛹期的齿腿长尾小蜂幼虫Parasitic larvae in Y. padella； b： 齿腿长尾小蜂幼虫Larvae of M. sp.； c： 体，侧面观Body, lateral view； d： 头，正面观Head, anterior view； e： 并胸腹节Propodeum； f： 中胸，背面观Abdomen, dorsal view.

生物学： 在苹果巢蛾的蛹壳中获得齿腿长尾小蜂的幼虫，幼虫成淡黄色梭状(图5a、b)。主要寄生于膜翅目和鳞翅目的幼虫和蛹(刘德力， 1990； 胡婷玉等， 2010)。

2.3.3 群瘤姬蜂 标本信息： 5♀， 2017-06-28，采集于新疆伊犁地区巩留县大莫合乡野果林(海拔： 1 357 m)通过饲养苹果巢蛾的蛹获得(图6)。

图6 群瘤姬蜂成虫外部特征Fig. 6 The morphological character istics of I. sp.a： 群瘤姬蜂成虫Adult of I. sp.； b： 头，正面观Head, anterior view； c： 翅Wing of I. sp.； d： 触角Antenna.

生物学： 主要寄生于多种鳞翅目和鞘翅目的幼虫(刘经贤， 2009)。

2.3.4 巢蛾多胚跳小蜂 标本信息： 5♀， 2017-07-07，采集于新疆伊犁地区伊宁县吉尔格朗沟野果林(海拔： 1 165 m)通过饲养苹果巢蛾幼虫所得(图7)。

图7 巢蛾多胚跳小蜂外部形态特征Fig. 7 Adult of showing external features A. fuscicollisa： 头，正面观Head, anterior view； b： 腹部，正面观Abdomen, anterior view； c： 触角Antenna； d： 翅Wing； e： 足Leg.

COI基因序列： 在NCBI数据库中上传巢蛾多胚跳小蜂COI序列(GenBank登录号为MW523952)。

生物学： 室内饲养获得的巢蛾多胚跳小蜂，主要寄生于苹果巢蛾的幼虫期； 其次，主要的寄主为鳞翅目的卵和幼虫。

生物学： 寄生于苹果巢蛾的幼虫期。主要寄主为鞘翅目瓢虫科和象甲科； 膜翅目姬蜂科和叶蜂科； 鳞翅目巢蛾科、卷蛾科、蠹蛾科和蛱蝶科等(张春田等， 2018)。

图8 选择盆地寄蝇形态特征Fig. 8 Morphological characteristics of B. parallelaa： 蛹壳Puparium； b： 成虫Adult.

2.4 优势寄生蜂巢蛾多胚跳小蜂的发育历期、寄生率和雌雄比测定

巢蛾多胚跳小蜂多营多胚生殖，将卵产于寄主体内汲取寄主营养物质，寄主被寄生后并不影响其正常的生长发育，1～3龄被寄生的幼虫取食较缓慢，4～5龄幼虫会减少食量，最终停止进食而死亡或提前吐丝结茧。在寄主老熟幼虫期，完成自身发育并钻孔羽化，最终导致寄主死亡； 被寄生的寄主幼虫呈棕褐色，全身僵硬似干枯状，像自然枯死(图9)。巢蛾多胚跳小蜂雄蜂先羽化，羽化多发生在清晨(7—8时)，在不补充水和营养的条件下，成蜂最长寿命为2天。本试验采集并饲养苹果巢蛾数量为130头，获得巢蛾多胚跳小蜂119头，寄生率为91.54%； 其寄主数量为32头饲养获得寄生蜂为12头，寄生率为37.50%，共统计了7组，其平均寄生率为64.52%，为本次调查苹果巢蛾幼虫的优势寄生蜂。

图9 巢蛾多胚跳小蜂的羽化Fig. 9 Ecolosion of A. fuscicollisa： 被寄生的苹果巢蛾幼虫Parasitized larvae of Y. padella； b、c： 放大后的蛹壳Enlarged puparium； d、e： 巢蛾多胚跳小蜂蛹Pupa of A. fuscicollis； f： 巢蛾多胚跳小蜂成虫Adult of A. fuscicollis.

根据10个组羽化出的巢蛾多胚跳小蜂雌雄数据统计，10个组分别用1～10来编号(图10)。结果表明，同一批羽化出的巢蛾多胚跳小蜂的雌雄主要分为3种情况，即全为雌蜂、全为雄蜂或雌雄蜂均有。巢蛾多胚跳小蜂的雌蜂数量明显高于雄蜂，雌蜂数量占比均在78%以上，雌雄性比约为3.5∶1。

图10 巢蛾多胚跳小蜂的羽化数量Fig. 10 The emergence number of A. fuscicollis百分比为每组雌蜂数量与每组寄生蜂总数量的比值。The percentage is the ratio of the number of females in each group to the total number of parasitic wasps in each group.

3 讨论

新疆西天山伊犁河谷水土条件优越，保存了大量的原始针叶林、野苹果和野核桃等多种重点保护植物，但是却受到虫害的威胁。利用寄生性天敌进行生物防治是控制自然生态系统中许多害虫生长的重要方法，也是保护野生树木的重要手段之一。苹果巢蛾是一类重要的食叶害虫，对野果林中野生果树的危害也逐年加重，因此需要对苹果巢蛾的寄生性天敌进行研究。首先对苹果巢蛾的形态特点和生活史进行描述，了解该害虫的发育历期，通过对苹果巢蛾生活史的调查发现其在幼虫期对果树的危害最为严重，今后可在害虫的卵到幼虫期进行重点防治，从而产生较好的防治效果； 其次对饲料苹果巢蛾所获得的5种寄生性天敌进行分类鉴定，可为后续苹果巢蛾寄生性天敌的鉴定提供参考资料。本试验进一步确定巢蛾多胚跳小蜂为苹果巢蛾幼虫期寄生蜂，而且寄生率为64.52%，此结果与前人研究结果基本一致(哈米提等， 2011)，不同之处在于本次研究中所发现的5种寄生性天敌，其中的长尾啮小蜂为其蛹期寄生蜂，而该寄生蜂是首次在苹果巢蛾中被发现。长尾啮小蜂主要寄生于该害虫的蛹中，每头蛹出蜂42～61头且雌蜂比雄蜂数量多，而国内外对长尾啮小蜂的研究表明其可寄生于美国白蛾的蛹、桑天牛卵(杨忠岐等， 2003)和台湾的刺桐树(Erythrina)(Yangetal., 2014)，也可寄生于象甲科昆虫的卵(Jacasetal., 2005)。由于长尾啮小蜂的寄主种类多样，且在生物防治中的效果显著，后续可对其寄生生物学进行更深入的研究，确定寄生能力和防治潜力。

优势寄生蜂巢蛾多胚跳小蜂在其羽化过程中发现雄蜂先于雌蜂羽化，雌蜂占比在78.5%以上，且存在产雌孤雌生殖和产雄孤雌生殖现象，产生此现象的原因与寄主的大小、雌蜂与寄主的相遇几率、饲养温度和光周期、产卵时雌蜂个体的营养等外在因素相关(Clearyetal., 2004)，该生殖方式对后代的繁殖和延续均有积极影响，也对人工扩繁有重大意义。Lee等(2007) 发现巢蛾多胚跳小蜂在苹果巢蛾幼虫的不同龄期表现出不同的寄生率，且寄生率的高低还会受到温度和寄主生长的影响。因此，在后续大量人工扩繁巢蛾多胚跳小蜂的过程中，需要考虑到寄主的龄期，确定合适的外界条件从而获得更多的寄生蜂，达到更好的防治效果。

在研究过程中发现，对寄生性天敌的鉴定方面仍存在一定困难。1) 长尾啮小蜂属是姬小蜂科中极大的属，世界范围内已知有813个种且在NCBI数据库中种的分子信息也极少，从属鉴定到种较为困难； 2) 室内饲养获得的齿腿长尾小蜂和群瘤姬蜂这2类寄生蜂与哈米提等研究者报道的虽为同一个属，但是经过传统形态学的比较，证明了它们并非同一个种，后续会使用整合分类学对其进行研究，鉴定至种； 3) 室内饲养出的巢蛾多胚跳小蜂为优势寄生蜂，但是巢蛾多胚跳小蜂需要通过制作玻片标本进行形态鉴定，过程较复杂。如出现标本残缺时，无法通过形态进行鉴定，可通过DNA条形码技术解决残缺标本鉴定的问题。由于巢蛾多胚跳小蜂的COI基因序列在NCBI数据库及BLOD数据库中均未被报道，因此，在本研究中通过扩增该寄生蜂的COI基因获得了巢蛾多胚跳小蜂的基因序列，并将其上传至数据库，目前该基因序列在NCBI和BLOD数据库中均可查到，后续只需提取DNA扩增COI基因进行序列比对，就可以确定是否为巢蛾多胚跳小蜂，为物种的鉴定提供参考。综上所述，对寄生性天敌的鉴定方面尽管存在一些困难，但是利用一些新的技术方法，可以解决大部分问题。在今后可以同时利用形态分类和分子DNA条形码(Perryetal.， 2019)等鉴定方法进行物种分类，通过与国内外的专家进行交流学习，将苹果巢蛾的寄生性天敌鉴定到种级水平。

寄生蜂虽然个体微小，却在害虫的生物防治中扮演重要角色。目前，我国对苹果巢蛾的防治主要还是以传统的化学防治和农业防治为主。化学防治见效快但会对其他的野生保护植被造成影响，建议可采用化学防治与生物防治相结合的综合防治方法，比如喷洒农药时可利用寄生蜂群落的消长动态，避开寄生蜂高峰期(6月)，选择低毒和无残留农药进行该害虫防治。西天山野果林是重要的果树起源地，其野生果树资源尤为重要，整体的环境保护对寄生蜂资源的多样性及开发和利用有着非常重要的作用，所以天敌昆虫资源的研究就显得尤为重要。利用寄生性天敌对西天山野果林的苹果巢蛾进行防治，目前只是处于基础研究阶段，对寄生蜂的分子鉴定以及扩繁和林间释放尚有待进一步研究。

4 结论

本研究从苹果巢蛾幼虫和蛹中饲养获得4种寄生蜂和1种寄蝇，其中巢蛾多胚跳小蜂为优势寄生蜂且对苹果巢蛾的幼虫寄生能力较强，而长尾啮小蜂为首次记录的苹果巢蛾寄生蜂。苹果巢蛾幼虫期对伊犁西天山野果林危害最为严重，因此在幼虫期进行防治尤为关键，采用生物防治的手段，既可保护珍贵的野生果树资源又可以扩大寄生蜂的数量确保寄生蜂资源丰富度。因此，本研究为我国苹果巢蛾的生物防治提供科学依据，并建议应当利用本土寄生性天敌保护西天山野果林的野生果树资源。