独龙牛精液冷冻稀释液配方的优化实验

王文,赵家才，李雯，欧阳晓芳

(云南省种畜繁育推广中心，云南 昆明 650212)

二十世纪四十年代到六十年代，家畜人工授精的应用取得了突破性进展， Smith和 Polge研究牛精液的冷冻保存方法获得了成功。当前，牛冷冻精液人工授精技术得到普遍的推广应用，荷斯坦奶牛100%应用冷冻精液人工授精，肉牛杂交改良人工授精普及率达90%以上。独龙牛是云南省贡山独龙族怒族自治县的地方良种，属于黄牛属中独立的一个种(Bosfrontalis)，处于半家养状态的濒危牛种，为国家二类保护动物，种群数量仅为2000余头。独龙牛精液冷冻稀释液配方的优化实验，有助于独龙牛种质资源保护和遗传物质保存，独龙牛冷冻精液质量与稀释液成分、温度变化的控制、抗冻剂的种类和含量、平衡时间、降温和冷冻速度密切相关。稀释液是生产冷冻精液的重要原料，稀释液配方的好坏直接影响冷冻精液的质量和产量。稀释液的主要作用是为精子提供能量来源，防止低温冷冻损伤，提供缓冲剂，调节酸碱平衡、防止pH值的有害变化，维持适当的渗透压和电解质平衡，抑制细菌生长，防止冷冻损伤[1]。糖类是精子能量的重要来源，其作用是补充精子的能量消耗；抗冻剂(如丙三醇、乙二醇和二甲基乙酰胺等)能够降低溶液冰点，减少和避免冷冻、解冻过程对精子的损伤；氨基酸具有良好的营养功能。

1 材料和方法

1.1 独龙牛精液的来源和采精方法

供试验的独龙牛从怒江州贡山独龙族怒族自治县九目当保种场引进5头，年龄3～6岁，独龙牛常年野牧，定时补饲食盐，2010年迁地引入和风土驯化，用电刺激法采精[2]。

1.2 基础液的配制和精液稀释

用电子天平(型号：DT-100A)准确称量所需各种试剂，制成浓度为0.2 M的三(羟甲基)氨基甲烷〔三(羟甲基)氨基甲烷2.42g、柠檬酸1.36g、果糖1.0g、卵黄20mL，双蒸水加至80mL〕基础液，每毫升基础液分别加入500～1000μg链霉素、500～1000IU青霉素。用奥林巴斯相差显微镜(型号：BX43)测定精子活力，分光光度计(型号：RS232)测定精子密度，精液的稀释采用一步稀释法。按每支细管精液最终含2300万～2500万个精子，确定添加的稀释量，一次性加入所需稀释液，然后在4℃下平衡2～4h。加入稀释液时，稀释液的温度和精液温度相差不能超过5℃。精液品质的检查按国家牛冷冻精液标准进行检验，测定公牛的采精量、精子活力、精子密度等指标[3，4]。

1.3 独龙牛精液冷冻稀释液添加防冻剂试验

独龙牛精液冷冻稀释液防冻保护剂浓度试验，在基础液中分别添加1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、13%和15%的丙三醇得到13个稀释液，分别编号待用；在基础液中分别添加2%、4%、6%、7%、8%、10%、12%的乙二醇得到7个稀释液，编号备用；在基础液中分别添加2%、3%、4%、5%和6%的二甲基乙酰胺得到5个稀释液，编号备用。取同一头公牛精液等量加入待试验的稀释液，依次检查记录各个稀释液稀释后的精子活力和解冻活力。冻精制作程序、冷冻曲线、解冻温度等完全一致。

1.4 独龙牛精液冷冻稀释液添加氨基酸的效果试验

独龙牛精液冷冻稀释液氨基酸添加量试验，在基础液中分别添加0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%、1.75%的半胱氨酸制成7种稀释液；在基础液中分别添加0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、2%的精氨酸制成5种稀释液；在基础液中分别添加0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.5%和2%的甘氨酸制成6种稀释液，前述供试稀释液逐一编号备用。处理方法同1.3。

1.5 冷冻稀释液的优选

按正交设计法要求分别将实验果糖、葡萄糖、丙三醇、乙二醇、二甲基乙酰胺和半胱氨酸、精氨酸和甘氨酸配比，使用L9(34)正交表确定稀释液配方和安排试验，优选出5个冷冻效果良好的组合，再进行对比试验。

1.6 独龙牛精液的分装和冷冻

独龙牛原精活力60%以上、精子密度为6.0亿/mL以上，其他指标无异常的精液，在等温条件下用不同的冷冻稀释液作相应比例的稀释，稀释后的精液先缓慢降温至室温时再放入4℃的冰箱中继续降温平衡2～4h，经平衡后的精液在低温操作柜中用细管分装一体机(型号：MRS-3)进行分装、封口和印字标记。冷冻精液时把细管精液水平放于细管冷冻架上[5]，然后放入程控冷冻仪(型号：DIGITCOOL5300)中冷冻。冷冻程序：启动程控仪，从室温以5℃/min的速度降温至4℃，保持2min，放入精液后在4℃下保持0.5min，从4℃以5℃/min的速度降温至-10℃，从-10℃以40℃/min的速度降温至-100℃，从-100℃以20℃/min的速度降温至-140℃，最后把冷冻后的冻精浸入液氮中随机抽样解冻，解冻温度为(40±2)℃。检查解冻后精液品质。冻精解冻活力达35%以上者方可保存。

1.7 数据统计分析

实验数据用生物统计方法进行统计分析[6]。

2 结果与分析

独龙牛用电刺激法采精，采精量为(5.24±2.37)mL，原精活力为(67.51±15.47)%，精子密度为(4.43±4.59)亿/mL，解冻活力为(36.35±2.29)%。

2.1 基础液中不同浓度防冻保护剂试验结果

见表1。

2.2 基础液中不同浓度氨基酸试验结果

见表2。

表2 不同浓度氨基酸试验结果 单位：%

2.3 正交试验结果

2.3.1乙二醇正交试验统计检验结果

F因素(葡萄糖)：试验水平为F1(0.5%)、F2(1.0%)和F3(1.5%)；E2因素(甘氨酸)：试验水平为E21(0)、E22(0.25%)和E23(0.50%)；G因素(乙二醇)：试验水平为G1(4%)、G2(5%)和G3(6%)正交试验。结果是F和E2因素对精子冷冻解冻活力影响极显著(P<0.01)，F1极显著优于F3，F2显著好于F3，F1和F2间差异不明显, 最佳组合为F1E21G3。

2.3.2二甲基乙酰胺正交试验统计检验结果

D2因素(精氨酸)：试验水平为D21(0.250%)、D22(0.375%)和D23(0.500%)；B2因素(果糖)：试验水平为B21(0.50%)、B22(0.75%)和B23(1.00%)；H因素(二甲基乙酰胺)：试验水平为H1(2.0%)、H2(3.0%)和H3(4.0%)正交试验。结果显示3个因素不同水平间差异不显著(P>0.05)，最佳组合为D23B22H2。

2.3.3半胱氨酸正交试验统计检验结果

A因素(半胱氨酸):试验水平为A1(0)、A2(0.25%)和A3(0.50%)；B1因素(果糖):试验水平为B11(0.5%)、B12(1.0%)和B13(1.5%)；C因素(丙三醇):试验水平为C1(5%)、C2(6%)和C3(7%)进行正交试验[7]。结果显示3个因素不同水平间差异均不显著(P>0.05),最佳组合为A2B11C2。

2.3.4精氨酸正交试验统计检验结果

D1因素(精氨酸):试验水平为D11(0)、D12(0.50%)和D13(0.75%)；B1因素(果糖): 试验水平为B11(0.5%)、B12(1.0%)和B13(1.5%)；C因素(丙三醇):试验水平为C1(5%)、C2(6%)和C3(7%)进行正交试验。结果表明3个因素不同水平间差异不显著(P>0.05)，D13优于其他两个水平，最佳组合为D13B11C2。

2.3.5甘氨酸正交试验统计检验结果

E1因素(甘氨酸)：试验水平为E11(0)、E12(0.50%)和E13(0.75%)；B1因素(果糖):试验水平为B11(0.5%)、B12(1.0%)和B13(1.5%)；C因素(丙三醇)：试验水平为C1(5%)、C2(6%)和C3(7%)正交试验。结果表明E1因素对精子冷冻解冻活力影响显著(P<0.05)，E13显著低于E11，E11和E12以及E12和E13间差异不明显， 最佳组合为E11B11C2。

2.4 不同配方稀释液的试验结果

根据上述试验结果，以不同正交试验效果最好的因素水平组合配制稀释液，以基础液+6%丙三醇稀释液为对照组进行对比试验，结果见表3。

表3 不同稀释液对独龙牛精液的稀释、冷冻解冻效果

3 讨论与小结

3.1 添加半胱氨酸对独龙牛精子冷冻效果

由表3的结果得出，稀释液中添加半胱氨酸较对照组显著提高了独龙牛精子冷冻解冻活力(P<0.05)，复苏率高于对照组，但差异不明显(P>0.05)，原精活力与对照组无明显差异(P>0.05)。半胱氨酸有缓冲、抗氧化、抗菌、解毒等作用，可以降低体液冰点，是生物抗冻蛋白的主要成分，Bilodeau等在解冻后的牛冷冻精液中加入0.5μmol半胱氨酸，结果可以使精子活力在没有外部氧化压力的情况下维持较高水平达6h以上。添加半胱氨酸有助于提高独龙牛精子冷冻效果。

3.2 添加精氨酸和甘氨酸对独龙牛精子冷冻效果

表3结果表明，稀释液中添加精氨酸独龙牛精子冷冻解冻活力和复苏率比对照组提高，但差异均不明显(P>0.05)。精氨酸能产生具有许多生理功能的重要递质，参与杀灭微生物，介导一系列免疫过程，对机体起着全方位的保护作用；O Flaherty等的试验表明，精氨酸可以促进冷冻解冻后牛精子的获能和顶体反应；本试验表明，冷冻稀释液中添加精氨酸对独龙牛精子冷冻保存是有益的。在稀释液中添加甘氨酸，未能提高独龙牛精子冷冻解冻活力和复苏率，精子冷冻解冻活力极显著低于对照组(P<0.01)。

3.3 乙二醇对独龙牛精子冷冻的影响

从表3得出，使用乙二醇为防冻保护剂，独龙牛精子冷冻解冻活力极显著低于使用丙三醇和二甲基乙酰胺的稀释液(P<0.01)，精子复苏率低于50%；制作独龙牛冷冻精液时使用乙二醇为防冻保护剂的效果低于鸡制作冷冻精液时使用乙二醇为防冻保护剂的效果，乙二醇不宜作为独龙牛精子冷冻抗冻剂。

3.4 二甲基乙酰胺对独龙牛精子冷冻的影响

表3显示，使用二甲基乙酰胺作为独龙牛精子冷冻保存的防冻保护剂，其效果优于乙二醇，低于丙三醇，且差异均极显著(P<0.01)，精子冷冻解冻活力能够达到30%以上。

3.5 丙三醇对独龙牛精子冷冻的影响

由表3的结果和正交试验结果可以得出，丙三醇作为独龙牛精子冷冻保存的防冻保护剂，其效果最佳，极显著优于乙二醇和二甲基乙酰胺(P<0.01)；丙三醇能促使稀释液呈过冷和微晶冻结状态，使精液呈玻璃样冻结状态，其作用相当于“盐的缓冲液”，能溶解剩余的盐，在冷冻解冻时，保持盐浓度低于临界限度。所以，独龙牛精子冷冻解冻活力和复苏率均较好，是最理想的防冻保护剂，不同配方中的用量均以6%最好。

3.6 优选出冷冻保存效果较好的冷冻稀释液

冷冻保存效果最好的冷冻稀释液是A2B11C2，即半胱氨酸0.25g、果糖0.5g、丙三醇6mL、三(羟甲基)氨基甲烷2.42g、柠檬酸1.36g、卵黄20mL，双蒸水加至100mL；其次是D13B11C2配方，即精氨酸0.75g、果糖0.5g、丙三醇6mL、三(羟甲基)氨基甲烷2.42g、柠檬酸1.36g、卵黄20mL，双蒸水加至100mL；稀释液添加0.5%葡萄糖和0.5%果糖均获得良好的冷冻效果；添加3种氨基酸的试验中，0.25%半胱氨酸和0.75%精氨酸精子冷冻效果理想,冻精解冻活力均高于毛翔光等[8]的研究结果。防冻保护剂以6%丙三醇最好，乙二醇添加量为6.0%、二甲基乙酰胺为3.0%具有防冻保护作用。基础液添加葡萄糖和果糖，半胱氨酸、精氨酸和甘氨酸，丙三醇、乙二醇和二甲基乙酰胺是否存在互作效应，本试验未进行研究，有待今后深入开展研究。

冷冻稀释液是影响独龙牛精液冷冻效果的主要因素，还应进行系统地筛选，今后仍需做深入的试验，以期进一步提高独龙牛冷冻精液品质。不同配方稀释液间冷冻效果的差异明显。

试验中不同配方冷冻稀释液对独龙牛原精的保存效果和精子冷冻解冻复苏率无明显影响，对精子的冷冻保存效果存在差异。丙三醇、乙二醇和二甲基乙酰胺为常用的渗透性防冻保护剂，此类防冻剂多属低分子中性物质，在溶液中易结合水分子发生水合作用，使溶液黏性增加，从而弱化了水的结晶过程，达到保护目的；糖类除了提供能量外，为非渗透性防冻保护剂，能溶于水，但不能进入细胞，能使溶液呈过冷状态，即可在特定温度下降低溶质浓度，从而起到保护作用；柠檬酸、柠檬酸盐和三(羟甲基)氨基甲烷为缓冲剂，柠檬酸和柠檬酸盐是一种简单的缓冲物质，三(羟甲基)氨基甲烷具有良好的缓冲性能，是维持pH值稳定和渗透压的重要物质。研究表明，独龙牛冷冻稀释液中添加适量的半胱氨酸或精氨酸，能显著提高精子冷冻解冻活力和复苏率，添加甘氨酸则无前述之效果。本试验优选得出具有良好保存效果的独龙牛精液冷冻稀释液，可制作质量良好的冷冻精液。