主成分因子加权结合Box-Behnken响应面法优化栀子微波预处理工艺研究

★ 黄潇 刘婧 陈瑶 付小梅 阚瑞 钟瑞 毛喜凤 郑宇枫（江西中医药大学 南昌 330004）

栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoidesEllis的干燥成熟果实，在我国分布较为广泛，是传统中医清热利胆方中的常用中药，现代研究发现栀子所含成分具有保肝利胆、抗菌消炎、降压降脂等作用［1］。栀子通常在霜降前后采摘，采摘后的栀子在干燥前，需以水蒸或水煮方式进行短时间的加热“杀青”操作，目的是对栀子进行灭酶处理。栀子中所含的多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）是导致栀子采摘后出现褐变、发黑的主要原因［2］，灭酶效果的好坏直接决定了栀子干燥后的外观色泽和有效成分的含量，甚至影响干燥后的成品药材在储存期间的稳定性［3］。

传统水蒸或水煮的方式虽然操作简单，但一直存在灭酶效率低、能源消耗大、易造成有效成分损失等缺点。微波作为一种介电加热技术，具有节能环保、灭酶高效、操控简单等优点，目前已经较为成熟和广泛的的应用于蔬菜、水果、肉类、谷物等食品领域［4］。微波应用于中药加工的报道大多集中于药材的干燥、炮制和提取环节，研究通常以有效成分含量为标准，讨论微波对于传统加热方式的替代性。近年来，微波应用于中药材产地加工的灭酶环节的研究也开始出现报道，李亮等［5］发明了一种包含微波灭酶工序的白芷饮片加工方法，能保证长期保存下白芷颜色、质量保持稳定。张小天等［6］研究发现微波处理后的青翘样品与传统方法比较，连翘酯苷A含量、连翘酯苷A水解酶灭活率均无明显差异，但微波炮制工艺更节省时间和能源。

微波预处理技术用于中药灭酶，其工艺关键是取得较好“灭酶”效果的同时，能够降低微波热效应对于药材有效成分的影响，实现“保质”的目的。本实验采用Box-Behnken响应面法设计，将微波处理后鲜栀子样品的PPO活性、POD活性和褐变指数（BI）通过主成分因子分析法（principal component analysis，PCA）分配权重得到综合得分做为“灭酶抑褐”指标、以干燥后栀子样品所含指标性成分栀子苷的含量做为“保质”指标，对栀子微波预处理工艺进行优化，为丰富中药材产地加工新技术、新方法的引入提供一定的理论研究基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

UV-2100紫外分光光度仪（上海美谱达仪器有限公司）；P70D20D微波炉（广东格兰仕集团有限公司）；Agilent 1200高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；5418型离心机（德国艾本德股份公司）；D5100尼康单反相机（尼康光学仪器（中国）有限公司），DE-3350数位式照度仪（得益工业仪器有限公司）。

1.2 材料

栀子苷为自制，以1H-NMR、1C-NMR、MS鉴定结构，面积归一法计算质量分数大于98%；PPO测试盒（批号A136-1-1）、POD测试盒（批号A084-3-1）购自于南京建成科技有限公司。乙腈、甲醇购自于天津市大茂化学试剂厂（色谱纯）；磷酸购自于西陇化工股份有限公司（分析纯）；水为超纯水。栀子采收于江西省上饶市玉山县，经江西中医药大学药学院范崔生教授鉴定为茜草科植物栀子Gardenia jasminoidesEllis的果实。鲜栀子采收后立刻冷藏保存，并于12 h内进行微波预处理。

2 方法与结果

2.1 PPO与POD的活性测定

2.1.1 粗酶液制备将鲜栀子整粒置于玻璃托盘内，平铺厚度约3.5～4 cm，进行微波预处理后，取5 g，加入pH 7.0、浓度0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液25 mL，冰浴条件下制备成匀浆液，纱布过滤后，以4 000 r/min离心10 min，取上清液即为粗酶液，保存于4 ℃冰箱以备供试。

2.1.2 PPO酶活性测定按试剂盒说明书操作，配制PPO酶活性测定液：将粗酶上清液0.9 mL，试剂盒试剂二3.6 mL、试剂三0.9 mL加入测定管，对照管加入煮沸的粗酶上清液0.9 mL，盒试剂二3.6 mL、试剂三0.9 mL加入测定管。将测定管和对照管于37 ℃下孵育10 min，取出转入90 ℃以上水浴5 min后流水冷却，离心机10 000 r/min离心10 min。取上清液以紫外分光光度计于420 nm处测定吸光度，以吸光度值变化0.001为1个PPO酶活性单位，即

2.1.3 POD酶活性测定按试剂盒说明书操作，配制POD酶活性测定液：于测定管中加入粗酶上清液0.15 mL，试剂一3.6 mL、试剂二0.45 mL、试剂三0.3 mL。对照管加入粗酶上清液0.15 mL，试剂一3.6 mL、试剂二0.45 mL、双蒸水0.3 mL,测定管和对照管于37 ℃水浴30 min，各加入试剂四1 mL，后于离心机以3 500 r/min离心10 min，取上清液以紫外分光光度计于420 nm处测定吸光度。以吸光度值变化0.001为1个PPO酶活性单位，即

2.2 褐变指数测定

褐变指数（BI）是表达栀子褐变程度的数值，由颜色模型量化值L（明暗程度）、a（红绿程度）、b（黄蓝程度）计算获得。按“2.1.1”将微波处理后的鲜栀子制备成匀浆液，纱布过滤后取5 mL，光源照度稳定情况下，以数码相机和Photoshop软件［7］读取颜色量化值L、a和b，代入Palou等［8］公式计算褐变指数，公式如下：

消费者信心指数(CCI)：是反映消费者信心强弱的指标，是综合反映并量化消费者对当前经济形势评价和对经济前景、收入水平、收入预期及消费心理状态的主观感受，预测经济走势和消费趋势的一个先行指标。该指标通过对城市消费者进行问卷调查，由国家统计局中国经济景气监测中心负责调查统计并发布。

式中：X=（a+1.75L）/（5.645L+a-3.012b）

2.3 栀子苷的定量测定

2.3.1 色谱条件［9］Agilent Eclipse XDB C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.2%磷酸；洗脱程序：0～10 min，6%乙腈；10～18 min，6%～12%乙腈；18～22 min，12%～16%乙腈；22～28 min，16%～20%乙 腈；28～40 min，20%乙 腈；40～60 min，20%～36%乙腈；60～65 min，36%～55%乙腈；流量1 mL/min；进样量5 μL；柱温30 ℃；检测波长为238 nm。色谱图见图1。

图1 栀子苷对照品（A）和供试样品（B）在238 nm处的HPLC图谱

2.3.2 栀子苷对照品溶液制备按照《中国药典》（2020版）［10］方法，精密称取栀子苷对照品适量，以60%甲醇溶解制成栀子苷浓度为0.5 g/L的对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液制备鲜栀子样品经微波灭酶处理后，置于烘箱内于55 ℃下干燥至含水量满足《中国药典》（2020版）［10］要求（<8.3%），干燥后栀子样品粉碎后过四号筛，精密称取0.2 g置于锥形具塞瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，称定重量后以超声处理20 min，放冷后再称定，以60%甲醇补足减失的重量后过滤，精密量取续滤液10 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.3.4 线性关系考察取“2.3.2”栀子苷的对照品溶液分别稀释至原浓度的1/10、1/5、2/5、3/5、4/5、1倍，按“2.3.1”项色谱条件进行测定，以栀子苷对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得栀子苷峰面积与质量浓度的线性关系方程为Y= 6.966 3X+ 19.084，R2=0.999 8，线性范围为50～500 μg/mL。

2.3.5 精密度试验取栀子苷的对照品浓度0.6倍液，按“2.3.1”项色谱条件，连续进样6次，栀子苷峰面积精密度结果RSD为0.35%，表明仪器的精密度良好。

2.3.6 稳定性试验按“2.3.3”方法制备供试液，室温下分别在0、3、6、12、24、32 h按照“2.3.1”的色谱条件进行测定，得栀子苷峰面积的RSD分别为0.51%，表明供试品溶液在32 h内稳定性良好。

2.3.7 重复性试验按照“2.3.3”方法平行制备供试品溶液6份，并依“2.3.1”项下色谱条件进行测定，得栀子苷的浓度平均值为415.25 μg/mL，RSD值为0.86%，表明该方法重复性良好。

2.3.8 加样回收实验精密称取9份已知栀子苷含量的栀子样品粉末，每份0.1 g，等分3组，按样品中所含栀子苷含量的50%、100%和150%精密加入栀子苷对照品。按照“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，以“2.3.1”项色谱条件测定栀子苷含量，计算回收率。依据测定结果计算栀子苷的平均回收率为100.97%，RSD值为2.14%，加样回收率满足要求。

2.4 PCA确定灭酶抑褐综合得分

PCA是一种客观加权方法，能够以主成分分析所得的各成分特征值与相应方差贡献率为依据，确定样本权重［11］。本实验中，PPO活性U1、POD活性U2、褐变指数BI3个据的获取来源于微波处理后的鲜栀子样品，且3个数据与栀子药材最终品质成反比，而栀子苷数据则来源于《中国药典》（2020版）规定的干燥后的栀子样品且与药材最终品质成正比，因此，实验采用双指标，将PPO活性U1、POD活性U2、褐变指数BI3个数据以PCA方法分配权重，合并为“灭酶抑褐综合得分”指标，而将栀子苷含量作为“保质”指标共同分析。

2.5 响应面优化微波预处理工艺

2.5.1 试验安排在前期单因素实验研究基础上，选取微波功率（X1）、微波时间（X2）、药材处理量（X3）为考察因素，利用Design-Expert10.0.4进行Box-Behnken响应面设计，因素与水平见表1，设计方案与结果见表2。

表1 Box-Behnken响应面因素与水平

表2 响应面试验设计及结果

2.5.2 主成分因子法计算灭酶抑褐综合得分U1、U1按“2.1”项测定，BI按照“2.2”项，首先测得代表颜色量化值的L、a、b，见表3，然后代入项下公式得出。将U1、U2、BI数据利用SPSS 20.0软件，标准化处理后，进行主成分分析。以特征值λ>1为标准可提取出两个主成分，且累计贡献度可以达到96.549%，因此选择2个主成分计算权重。见表4。

表3 栀子微波预处理的L、a、b值

表4 主成分分析方差结果

将SPSS 20.0软件得出的两个主成分系数，除以其各自特征值的平方根得出两个主成分线性组合系数，见表5。以表4中第一主成分和第二主成分的方差贡献度为权重，对表5中主成分线性组合系数进行加权平均、归一化处理后则可得到U1、U2、BI三者分配权重的“灭酶抑褐综合得分”计算公式，Y1=0.5U1+0.21U2+0.29BI。

表5 主成分系数和线性组合系数

2.5.3 响应面试验结果分析利用Design-Expert 10.0.4，以微波功率（X1）、微波时间（X2）、药材处理量（X3）做为考察因素，对灭酶抑褐综合得分（Y1）和栀子苷含量（Y2）两个指标进行响应面回归拟合分析，得二次多项式回归方程分别为：

表6为Box-Behnkn响应面的方差分析结果，当P<0.05为表中结果显著项，P<0.01为极显著项。由表6可以看出，对于灭酶抑褐综合得分（Y1），考察的三个微波预处理工艺因素中，微波功率（X1）、微波时间（X2）、药材处理量（X3）的P值都小于0.01，均为极显著项。交互项中，X1X2（P=0.043 5）和X1X3（P=0.040 6）为显著项，二次项中，只有X12（P=0.006 1）为显著项。模型整体的显著性较高（P<0.000 1），失拟程度不显著（P=0.118 2），说明拟合出的二次多项式模型拟合程度较好，能够表达微波功率（X1）、微波时间（X2）、药材处理量（X3）与灭酶抑褐综合得分（Y1）指标的变化关系。对于栀子苷含量指标（Y2），考察的3个微波处理工艺条件中，微波功率（X1）（P=0.004 2）为极显著项、微波时间（X2）（P=0.021 8）为显著项，但药材处理量（X3）（P=0.171 0）不显著。交互项中，X1X2（P=0.028 7）为显著项，二次项中，（P=0.009 0）为极显著项。整体模型的显著性较高（P=0.005 9），失拟程度不显著（P=0.866 8），表明拟合出的二次多项式模型拟合程度较好，能够表达微波功率（X1）、微波时间（X2）、药材处理量（X3）与栀子苷含量指标（Y2）的变化关系。综合来看，Box-Behnkn法拟合结果可以用来分析和预测栀子微波预处理工艺。

表6 方差分析

图2为所得模型的3D响应面图，表明微波功率（X1）、微波时间（X2）、药材处理量（X3）的交互作用对灭酶抑褐综合得分（Y1）和栀子苷含量（Y2）的影响。

图2 各因素对考察指标的交互作用三维响应面图

2.6 响应面优化工艺选择与验证

2.6.1 优化方案选择按Design-Expert软件优化方案的指标选项中，有最大值、最小值、和范围内选项。由于本试验选用双指标，应保证栀子苷含量最大的情况下得到较小的灭酶抑褐综合得分，因此将栀子苷含量（Y2）选择为最大值，灭酶抑褐综合得分（Y1）选择为最小值和范围内两种优化方案进行验证。见表7。

表7 两种优化方案

2.6.2 优化方案的验证结合实际操作，将方案一的优化工艺调整为：微波功率550 W，微波时间105 s，药材处理量250 g；方案二的优化工艺调整为：微波功率700 W，微波时间114 s，药材处理量225 g。按调整后的工艺条件重复5次试验进行验证，结果见表8。工艺验证结果表明，方案二的灭酶抑褐综合得分和成分含量的RSD为别1.166%和为1.035%，明显优于方案一的5.819%和3.212%；两方案的优劣与表7中方案预测值相符，说明方案二的工艺具有更高的可靠性和重复性，故以方案二工艺为最佳工艺。

表8 工艺验证

3 讨论

《中国药典》（2020版）中对栀子有效成分及质量标准的描述是“含栀子苷不得少于1.8%”，对外观颜色性状则有“表面红黄色或棕红色”、种子为“深红色或红黄色”的要求。栀子的产量大、采收时间集中，在干燥前如不能及时的进行加热灭酶的预处理操作，其有效成分和外观颜色性状都会受到影响，药材质量无法得到保证。水蒸或水煮是目前常用的灭酶方式，《中国药典》（2020版）中对其操作要求为“蒸至上气或置沸水中略烫”。虽然长期的实践和大量研究已经证明水蒸或水煮的操作能够达到灭酶保苷目的，但该工艺缺点十分明显：首先热量的传递方式为由外到内，穿透效果差，对于影响栀子外观颜色性状、导致栀子产生“酶促褐变”现象的PPO和POD，如操作时间短会导致灭酶不彻底，时间长又会导致药材软烂和有效成分的流失，最终影响药材质量；另外，在各地方产地加工操作手册中，通常还会在水煮时加入明矾，可能会导致铝、钾离子进入药材，给后续中成药的加工、生产埋下一定隐患［12］。微波作为一种介电加热技术，能够使被加热物质所含的极性分子（水分子）在微波作用下发生振动，实现被加热物质由内到外的加热过程，热量穿透性强，能够在较短的时间内实现升温灭酶，解决水蒸或水煮操作带来的灭酶不彻底和有效成分流失等缺点，同时将药材预处理操作由经验化升级到数据化，提高工艺可控性的同时也节约了能源。

工艺的合理性是保证技术应用的前提，响应面设计试验是工艺优选的常用方法，近期越来越多的中药研究开始运用各种加权方法将多指标、多因素综合评分后进行评价［13-14］，从多维角度保证工艺的合理性。本实验从“灭酶”“抑褐”和“保质”角度研究微波预处理工艺：以微波处理后鲜栀子的样品的PPO、POD酶活性数据代表“灭酶”情况、颜色量化值L、a、b计算的褐变指数BI代表“抑褐”情况，并通过PCA加权后获得“灭酶抑褐综合得分”指标；同时考虑到微波预处理加热升温的本质，在带来“灭酶”和“抑褐”效果的同时，还可能破坏栀子中所含的有效成分，因此按照《中国药典》（2020版）对栀子有效成分的规定，将同批干燥后栀子样品中所含栀子苷含量作为“保质”指标。“灭酶抑褐综合得分”和栀子苷含量双评价指标确定后，利用Box-Behnkn响应面法考察微波功率、微波时间、药材处理量3个影响因素对2个指标的影响，保证了微波预处理工艺的全面性和合理性。

响应面研究结果表明，对于“灭酶抑褐综合得分”指标，考察的3个微波处理工艺条件中，微波功率、微波时间、药材处理量均为极显著项，分析其原因可能是鲜药材当中水分含量高，水分子作为极性分子在微波的作用下导致了显著的热效应。而对于栀子苷含量指标，3个影响因素中只有药材处理量为不显著项，原因可能是微波预处理后的干燥过程中的药材含水量逐渐降低，对微波的作用效果的响应程度较差，因此药材处理量的显著性小于微波功率和微波时间。在Box-Behnkn响应面工艺优化方案选择中，由于选择双指标评价，考虑药材加工的实际意义，试验以“保质”为最终目的，将栀子苷含量选取为最大值，灭酶抑褐综合得分为最小值和范围内两种优化方案进行验证。通过两种优化方案比较，最终确定最佳工艺为微波功率700 W，微波时间114 s，药材处理量225 g，验证结果表明该优化方案的工艺稳定可靠。

中药材的预处理属于产地加工范畴，是中药生产的上游环节，也往往是整个中药产业链条中最薄弱的阶段，其技术和加工手段常具备单一性、粗放性的特点，在一定程度上制约着中药材和中药制药产业的发展。微波加热技术的研究，能够为中药产地加工方法的丰富、中药材预处理的标准化、现代化水平提升和智能化加工设备的研发提供一定的理论基础。本实验只以《中国药典》（2020版）中规定的栀子有效成分栀子苷为“保质”指标进行研究，但栀子的化学成分复杂，微波预处理对于栀子其他主要成分的工艺考察有待进一步研究。