网络药理学联合临床探讨接骨七厘胶囊对腰椎骨折的疗效及作用机制

冯 莉 商 勋 赵小超 徐 盛 李 进

江苏省宿迁市中医院药学部，江苏宿迁 223800

接骨七厘胶囊（JGQLC）由大黄、当归、骨碎补、硼砂、乳香、没药、血竭、土鳖虫和自然铜9味中药组成，被《国家基本药物目录·基层医疗卫生机构配备使用部分》收录记载，具有活血祛瘀、接骨止痛的功效。JGQLC还具有抗炎，促进骨折愈合的作用[1-2]。腰椎骨折临床较为常见，主要通过椎板切除减压，对脊柱内固定进行治疗，腰椎骨折患者后期伴随许多并发症，发展复杂，致残率较高[3]，严重影响患者的生活质量。本研究通过临床病例回顾性分析JGQLC对腰椎骨折的疗效，网络药理学预测其对腰椎骨折的作用靶点及通路，讨论分析其作用机制，为进一步深入研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取宿迁市中医院骨科2020年6月至2021年8月收治的腰椎骨折术后患者63例进行回顾性分析研究，按用药情况分为两组，单用复方骨肽注射液患者为对照组（n=27），联合使用JGQLC为观察组（n=36）。对照组男10例，女17例，年龄24～69岁，平均（48.87±13.08）岁，胸腰椎（L1～L2）骨折14例、腰椎（L3～L5）骨折13例。观察组男17例，女19例，年龄22～68岁，平均（50.84±11.85）岁，胸腰椎（L1～L2）骨折21例、腰椎（L3～L5）骨折15例。两组患者一般资料比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05），具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准。

纳入标准：①影像检查确诊为L1～L5骨折且为初次腰椎骨折患者；②病例资料完整。排除标准：①不能遵从治疗方案或有严重精神疾病者；②具有原发性免疫缺陷疾病者或休克、恶性心律失常者；③有恶性肿瘤者；④对本研究药物过敏者；⑤处于孕期或哺乳期者；⑥合并心、肝、肾等重要脏器功能障碍者。

1.2 方法

对照组术后愈合采用复方骨肽注射液（智同生物制药，国药准字H20052314，批号：22101042）静脉滴注，每次150 mg溶于250 ml 0.9%氯化钠注射液中，1次/d。观察组在对照组基础上联合口服JGQLC（金沙药业，国药准字Z20053999，批号：211202），2 次 /d，2 片 /次，治疗 20 d。

1.3 观察指标及评价标准

①临床疗效判定标准[4-5]，治愈：疼痛消失、外形及功能基本恢复，骨折处愈合良好；显效：有轻微疼痛，外形及功能恢复欠佳，临床症状基本好转，骨折处愈合较好；无效：临床症状仍存在，骨折处畸形或不愈合。总有效率=（治愈+显效）例数/总例数×100%；②检查骨代谢指标，采用罗氏CobasE601系统测定患者治疗前后空腹状态下血清中钙、碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原羧基端肽β特殊序列（β-CTX）指标水平。

1.4 统计学处理

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（）表示，采用t检验，计数资料以 [n（%）]表示，采用χ2检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

1.5 药物-疾病间靶点预测及相互作用分析

通过 TCMSP（http: //tcmspw.com/tcmsp.php）及Batman-TCM（http: //bionet.ncpsb.org.cn/batmantcm/）检索JGQLC活性成分及靶点基因，条件为OB≥ 30%、DL≥ 0.18。经 DrugBank（https: //go.drugbank.com/）将化合物结构与靶点再次确认。利用UniProt（http: //beta.uniprot.org/）检索，选择“Homo sapiens”，剔除不符合条件、非人源的靶点，得到JGQLC的基因靶点。通过Gene Cards（https: //auth.lifemapsc.com/）和 OMIM（https: //www.omim.org/）检索腰椎骨折基因靶点，Venny 2.1.0软件获得交集靶点。将交集靶点导入Cytoscape 3.7.1软件进行可视化处理，构建药物-疾病-靶点网络关系图。

1.6 药物-靶点蛋白相互作用关系及核心靶点筛选

将交集靶点基因复制到String PPI 11.0软件，以人为研究对象，设置条件为mendium confidence＞0.9，剔除游离蛋白靶点，构建蛋白相互作用PPI网络。将获取的所有蛋白利用Cytoscape 3.7.1软件、CytoNCA插件对该网络进行拓扑分析，以度中心性（DC）、中介中心性（BC）、接近中心性（CC）和特征向量中心性（EC）的值表示重要节点，值越大，节点越大，相互作用的靶点就越多，说明该网络存在关键节点。输入关键节点的参数值绘制成三线表，再将重要的靶点和化合物导入Cytoscape 3.7.1中完善颜色并调整节点大小构建拓扑网络图。

1.7 GO功能富集与KEGG通路分析

利用 Bioconductor软件，借助 clusterprofiler、pathview、Dose包，通过R语言获得基因本体及通路富集数据并可视化，进行GO功能富集和KEGG通路分析，获得JGQLC在腰椎骨折中的关键性通路。

2 结果

2.1 两组临床疗效比较

2.1.1 两组总有效率比较 观察组总有效率为97.22%，高于对照组的88.89%，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见表 1。

表1 两组总有效率比较[n（%）]

2.1.2 两组骨代谢指标水平比较 治疗前两组钙、碱性磷酸酶、β-CTX水平比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。治疗后两组钙、β-CTX水平高于治疗前，碱性磷酸酶水平低于治疗前，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。治疗后观察组钙水平与对照组比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05），观察组碱性磷酸酶水平低于对照组，β-CTX水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见表 2。

表2 两组骨代谢指标水平比较（）

表2 两组骨代谢指标水平比较（）

注 β-CTX：Ⅰ型胶原羧基端肽β特殊序列

组别 n 钙（mmol/L） 碱性磷酸酶（U/L） β-CTX（ng/ml）治疗前 治疗后 t值 P值 治疗前 治疗后 t值 P值 治疗前 治疗后 t值 P值观察组 36 2.28±0.102.31±0.094.9080.000 87.72±5.19 67.63±4.37 66.285 0.000 93.49±5.39 130.95±6.56 126.7720.000对照组 27 2.29±0.092.30±0.078.0390.000 89.37±4.78 71.78±6.18 38.818 0.000 94.02±3.35 126.00±5.20 93.946 0.000 t值 0.391 0.476 2.632 -5.009 1.299 5.247 P值 0.699 0.638 0.098 0.000 0.204 0.000

2.2 药物-疾病间靶点预测及相互作用分析

共筛选出91个活性较高成分，大黄16个、当归2个、骨碎补18个、没药39个、乳香8个、土鳖虫1个、血竭6个、自然铜1个。通过Venny 2.1.0软件获得药物-疾病交集靶点216个，Cytoscape构建药物-疾病-靶点网络关系并进行拓扑学分析，见图1。长方形代表疾病靶点，圆形代表有效成分。数图结合分析的JGQLC针对腰椎骨折靶点孕酮受体（PGR）、前列腺素内过氧化物合酶1（PTGS1）、重组人视网酸X受体α（RXRA）、雄激素受体（AR）、细胞色素氧化酶基因（CYP1A1）、雌激素受体1（ESR1）、热休克蛋白90α家族A类成员 1（HSP90AA1）、白介素 -13（IL-13）、白介素 -1B（IL-1B）、氧化氮合酶（NOS2）等，预测JGQLC可能通过调控以上基因靶点对腰椎骨折发挥治疗作用。

图1 药物-疾病-靶点关系图

2.3 药物-靶点蛋白相互作用关系及核心靶点筛选

将交集基因导入String PPI 11.0数据库，来源选择Homo sapiens得到蛋白相互作用网络图，见图2。同时将交集基因导入Cytoscape 3.7.1软件，获得216个节点和4158条边（图3），设置条件DC≥29、BC≥66.46、CC≥0.51和EC≥0.04、LAC≥16.74，筛选出标黄的75个靶点，继续设置条件BC≥15.46、CC≥0.74、DC≥48、EC≥0.11、LAC≥37.54，筛选标黄的核心靶点31个。预测JGQLC可能通过以上核心靶点对腰椎骨折发挥治疗作用。已有文献报道过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）、ESR1、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、苏氨酸蛋白激酶 1（Akt1）、长应答蛋白 2（EGR2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）靶点与骨折存在相关性。

图2 蛋白相互作用网络图

图3 筛选核心靶点过程图

2.4 GO功能富集和KEGG通路分析

GO-BP共有2900个条目，设置P-value＜0.01，取校正P值前10的条目，主要涉及类固醇代谢过程、抗生素的反应、细胞对药物的反应、金属离子的响应、氧化应激的反应等。GO-CC共有68个条目，主要涉及质膜筏、内质网内腔、核染色质、RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合物、核转录因子复合物等（图6）。GO-MF共有173个条目，主要与脱氧核糖核酸-结合转录激活活性/特殊的RNA聚合酶Ⅱ、四吡咯结合、血红素结合、类固醇结合、转录因子活性等紧密关联。KEGG通路分析见图7，主要涉及脂质与动脉粥样硬化、白介素-17（IL-17）信号通路、PI3K-Akt信号通、MAPK信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等。

图6 GO功能富集分析

3 讨论

中医认为血循环于脉中，运行不息，濡养全身。骨折后，必伤血，故有“跌打损伤之症，专从血论”之说。活血祛瘀，续筋接骨是腰椎骨折的治疗原则，JGQLC以土鳖虫为君药，破瘀血，续筋骨，以骨碎补接骨续筋、活血疗伤，当归养血活血，血竭活血散瘀止痛为臣药，佐以大黄、没药、乳香活血散瘀，自然铜续筋接骨，硼砂消肿止痛，合众药之力，发挥续筋接骨疗伤、活血止痛之功效。临床证明，JGQLC对腰椎骨折有一定的促进愈合作用，可减少临床并发症[6]。

通过临床与网络药理学相结合的方法探讨JGQLC对腰椎骨折的疗效及机制，获得关键靶点、核心蛋白以及信号通路等重要信息。其中多个靶点、蛋白、信号通路已有研究证明与骨折存在一定关系。如通过调控雌激素受体α基因（ESR1）PvuII（C/T）和XbaI（A/G）多态性可降低骨折风险[7]。Jana等[8]发现过氧化物酶体增殖物激活受体γ与骨质疏松症的发病机制有关，可降低老年人的骨折风险。另有研究表明，骨折的愈合与血清因子、血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2、胰岛素样生长因子1、转化生长因子β密切相关[9-10]。

GO分析显示，JGQLC治疗腰椎骨折主要涉及类固醇代谢过程、类固醇激素的反应、脂多糖的反应。吴昊[11]发现细菌脂多糖可激活JAK2/STAT5信号通路，进而干扰成骨细胞正常的分化功能。王显威等[12]发现地塞米松（类固醇药物）对大鼠下颌骨折的愈合具有延缓作用。KEGG分析显示IL-17、AGE-RAGE、PI3K-Akt、MAPK 和肿瘤坏死因子等信号通路与腰椎骨折密切相关。研究发现激活PI3K-Akt通路可促进骨折愈合，激活MAPK通路可促进成骨细胞增殖，影响细胞骨架结构[13-14]，李文锋[15]发现NBD多肽通过与NEMO结合改善肿瘤坏死因子对成骨细胞的抑制作用。

综上所述，JGQLC对腰椎骨折的愈合具有促进作用，大数据分析提示其作用机制与多个信号通路及核心靶点有关，为今后进一步深入研究提供参考依据。