贝莱斯芽孢杆菌对烟草白粉病的毒力与防效及对烟草的安全性评价

夏丽娟，梁竟宇，李 靖，许中怀，董雪娟，万 莉*

(1.四川省农药检定所，四川 成都 610041；2.四川百事东旺生物科技有限公司，四川 青白江；3.西北农林科技大学，陕西 杨凌)

烟草白粉病病原菌为二孢白粉菌(ErysiphecichoracearumDC.)，属子囊菌亚门[1]，为气传真菌性病害，二孢白粉菌通过分生孢子产生初生牙管、附着胞，并以吸器从烟草细胞中获取营养而导致烟草枯叶、整株枯死、烟叶调制后缺乏弹性和香气而导致商品性下降[2]。烟草白粉病寄主广泛，对烟草生产危害性很强[3]，在中国华南、西南和华中烟区普遍发生，发病株率可达100%，发病叶率一般在10%～20%，严重的可达80%以上[4]。目前生产中防治烟草白粉病主要以三唑类杀菌剂等化学农药为主[5]。由于长期使用化学农药，抗性问题日益突出[6]，同时，由于化学农药的使用不但严重影响烟草的安全性，还会带来农药残留超标和环境污染等方面的问题[7]，生物药剂的开发使用是解决该问题的有效方法之一。

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)属于芽孢杆菌属的一个新种，是一种新型的微生物农药，在促进植物生长、抗病虫害、抗逆境和诱导植物系统抗病性方面效果明显[8-10]；其不易产生抗性、无残留、对环境友好[11]，目前已有将贝莱斯芽孢杆菌应用到农业病害上的研究，如贝莱斯芽孢杆菌3A3-15对尖孢镰刀菌孢子萌发抑制率高达93.2%[12]，贝莱斯芽孢杆菌Y6产生的脂肽类物质能够抑制约60%的真菌孢子萌发[13]，贝莱斯芽孢杆菌V4能够产生伊枯草菌素等抗菌物质[14]，尚未见贝莱斯芽孢杆菌应用于烟草白粉病的研究报道，本文测定并明确了贝莱斯芽孢杆菌对烟草白粉病的室内活性、田间防效及对烟草植株的安全性，以期为烟草白粉病生物防治领域的进一步研究提供支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料 供试菌株和烟草：二孢白粉菌ErysiphecichoracearumDC.由四川农业大学提供。烟草品种为红大、K326、云烟、中川208、烤烟。

试验药剂：1 000亿孢子/g贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis(CGMCC No.14384)母药、200亿孢子/g贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂；1 000亿孢子/g枯草芽孢杆菌B.subtilis母药；200亿孢子/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，吐温-80(化学纯)；6%嘧啶核苷类抗菌素水剂。

仪器：RXZ-430B人工气候箱，宁波江南仪器厂；WS-16型背负式喷雾器，山东卫士植保机械有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 贝莱斯芽孢杆菌对烟草白粉病菌的室内毒力测定 按盆栽法NY/T1156.11-2008测定毒力效果，烟草品种为红大，用质量分数为0.1%的吐温-80水溶液将贝莱斯芽孢杆菌母药和枯草芽孢杆菌母药分别稀释为0.1亿孢子/mL、0.5亿孢子/mL、1亿孢子/mL、2亿孢子/mL、5亿孢子/mL的系列浓度菌液。将上述系列浓度菌液均匀喷施至烟草叶片，使其全部润湿，每个浓度设4次重复，每个重复5盆烟草，以喷施含有等量0.1%吐温-80的水溶液为空白对照，自然晾干，备用。将保存的烟草白粉病菌于25℃、12h光照(10000 lx)/12h黑暗交替条件下培养，促使新鲜孢子囊产生，制成浓度为1×105～1×107个/mL的孢子悬浮液。将孢子悬浮液喷雾至药剂处理后24h的烟草叶面，于(20～24)℃温度下培养10d，待空白对照组病叶率达到80%左右时分级调查各处理的发病情况，分级标准为：0级，无病斑；1级，病斑面积占叶片面积的5%以下；3级，病斑面积占叶片面积的6%～10%；5级，病斑面积占叶片面积的11%～20%；7级，病斑面积占叶片面积的21%～40%；9级，病斑面积占叶片面积的41%以上。根据调查数据，计算病情指数和防治效果。病情指数=[Σ(各级病叶数×相应级数值)/(调查总叶数×9)]×100，防治效果=(空白对照病情指数-药剂处理病情指数)/空白对照病情指数×100%。

1.2.2 贝莱斯芽孢杆菌对烟草白粉病的田间防效试验 参照GB/T17980.30-2000开展田间药效试验，两地分别为山东泰安市泰山区，烟草品种为中川208，栽种规格0.5×0.9m，砂壤土；四川崇州市，烟草品种为烤烟，栽种规格0.5×0.8m，中壤土。均在烟草白粉病发病期或发病初期喷雾1次，间隔7d第2次喷雾。试验共设置5个处理：200亿孢子/g贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂1 500、2 250、3 000g/hm2，6%嘧啶核苷类抗菌素水剂75g a.i./hm2，空白对照。小区随机区组排列，每处理4次重复，小区面积30m2，小区间设保护行30cm。第2次药后7、14d调查，每小区4点取样，每点调查2株全部叶片，计算病情指数、防效。病情指数=[Σ(各级病叶数×相应级数值)/(调查总叶数×9)]×100，防效=(1-空白对照施药前病情指数×处理施药后病情指数/空白对照施药后病情指数×处理施药前病情指数)×100%。

1.2.3 贝莱斯芽孢杆菌对烟草植株的安全性试验 根据农药对作物安全性评价准则NY/T1965.1-2010，采用盆栽法，设置200亿孢子/g贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂田间最高推荐剂量、2倍及4倍最高推荐剂量(3 000、6 000、12 000g/hm2)，在3个烟草品种(红大、K326、云烟)3～4叶期喷雾，3个烟草品种各设1个空白对照，每处理30株，每处理4次重复。待烟草3～4叶期在每个重复中选取生长相对一致的10株烟草，测量从土表到烟草生长点的高度为株高，计算株高生长速率和株高生长抑制率，株高生长速率(mm/d)=(施药后植株株高-施药前植株株高)/施药前植株株高×施药前后间隔时间，株高生长抑制率=(空白对照株高生长速率-药剂处理株高生长速率)/空白对照株高生长速率×100%。喷雾后7、14、21d调查烟草是否有变色、坏死、萎蔫、畸形、生长停滞等药害症状及受害株数。

1.3 数据分析 按浓度对数-防治效果几率值分析(Bliss)法，采用DPS7.05软件计算毒力回归方程、EC50、EC90及95%置信限。用Duncan氏新复极差法进行试验数据的差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 贝莱斯芽孢杆菌对烟草白粉病菌的毒力 表1结果表明，贝莱斯芽孢杆菌对烟草白粉病菌的EC50值为0.322亿孢子/mL，EC90值为2.052亿孢子/mL，其毒力值是枯草芽孢杆菌对烟草白粉病菌的EC50值的3倍，EC90值的6倍，表现出较高活性。

表1 贝莱斯芽孢杆菌对烟草白粉病菌的室内毒力

2.2 贝莱斯芽孢杆菌防治烟草白粉病田间药效试验 由表2可知，200亿孢子/g贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂1 500、2 250、3 000g/hm2防治烟草白粉病，两地第2次药后7、14d防效均随着贝莱斯芽孢杆菌用量的增加而增加。在山东的田间药效试验中，第2次药后7d，200亿孢子/g贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂1 500、2 250g/hm2与对照药剂6%嘧啶核苷类抗菌素水剂75g a.i./hm2防效相当，200亿孢子/g贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂3 000g/hm2防效显著高于对照药剂。四川的试验中，第2次药后14d，200亿孢子/g贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂1 500、2 250、3 000g/hm2防效差异显著，2 250g/hm2与对照药剂6%嘧啶核苷类抗菌素水剂75g a.i./hm2防效相当。

表2 贝莱斯芽孢杆菌防治烟草白粉病田间药效试验结果

2.3 贝莱斯芽孢杆菌对烟草植株的安全性评价 由表3可知，在对3个烟草品种生长抑制作用方面， 200亿孢子/g贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂3 000、6 000、12 000g/hm2对红大的生长抑制率分别为-9.25%、-7.63%、-5.20%，对K26的生长抑制率分别为-8.43%、-7.88%、-5.43%，对云烟的生长抑制率分别为-5.39%、-6.69%、-7.26%，3个剂量对3个烟草品种的生长抑制率均无显著性差异，对烟草生长有5.20%～9.25%的促进作用。药后7、14、21d调查，烟草植株生长健康，无药害症状。

表3 贝莱斯芽孢杆菌对3种烟草植株生长的影响

3 结论与讨论

目前生产中防治烟草白粉病仍以化学农药为主，但长期大量使用化学农药产生的抗药性、农药残留、环境污染等问题日趋严重[3]。生防菌株的研发与应用对防治烟草白粉病具有重要意义，贝莱斯芽孢杆菌具有抗菌谱广、生长快、易培养、抗逆性强和生物安全性高等优点[15-16]，且含有多种菌肽基因组、聚酮类化合物[17-18]，能够产生拮抗蛋白类的抗菌物质，降解细胞壁的几丁质酶和葡聚糖酶，对真菌病原具有良好的拮抗作用[19-20]。

室内毒力测定结果表明，贝莱斯芽孢杆菌对烟草白粉病菌的EC50值为0.322亿孢子/mL，对烟草白粉病菌有较好的抑制效果，显著优于枯草芽孢杆菌。田间药效试验中，200亿孢子/g贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂1 500、2 250、3 000g/hm2山东第2次药后7d病指为0.9～1.9，防效为70.63%～82.44%，第2次药后14d病指上升为1.4～2.7，防效为65.00%～77.45%，四川第2次药后7d病指为5.1～6.7，防效为72.30%～78.82%，第2次药后14d病指上升为7.5～9.4，防效控制在70.42%～76.71%，贝莱斯芽孢杆菌防治烟草白粉病持效期较长且防效稳定。刘彩云[21]研究表明，喷雾生防菌株LB-1对烟草白粉病防效为44.90%，本文研究结果贝莱斯芽孢杆菌对烟草白粉病防效>65.00%，防效远高于生防菌株LB-1。

已有研究指出，虽然贝莱斯芽孢杆菌作为拮抗益生菌具有巨大的应用潜力，但其生物安全评价相关的研究较少，目前只有贝莱斯芽孢杆菌对动物安全性的报道，还应加强贝莱斯芽孢杆菌对应用植株的安全性研究[22]。本研究中200亿孢子/g贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂田间最高用量3 000g/hm2、田间最高用量2倍量6 000g/hm2、4倍量12 000g/hm2对3种烟草生长抑制率均无显著性差异，对烟草还有5.20%～9.25%的促进生长作用，烟草植株生长健康。

贝莱斯芽孢杆菌的使用可减少烟草白粉病杀菌剂的使用，对烟草白粉病菌抗药性的减缓有一定作用。考虑到生产实际，可结合多种措施，如贝莱斯芽孢杆菌与其它卵菌化学杀菌剂交替使用、与天敌昆虫或物理防治手段相结合，以达到持续控制烟草白粉病的目的。