circ_0000527和miR-1253在结直肠癌组织中的表达及其对直肠癌SW620细胞增殖、迁移及侵袭的影响

0 引言

结直肠癌是我国常见的一种恶性肿瘤,虽然结直肠癌诊断与治疗技术有所提高,但中晚期结直肠癌患者预后较差,因而仍需探究结直肠癌发生及发展的分子机制

.环状RNA(circular RNA,circRNA)在结直肠癌中表达异常,并可发挥重要调控作用

.circ_0000527在骨肉瘤组织中高表达,上调其表达可促进骨肉瘤细胞的增殖

.Circular RNA Interactome预测显示circ_0000527与miR-1253存在互补序列.研究表明

,miR-1253在结直肠癌组织和细胞中表达下调,抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭.因此,本研究主要探讨circ_0000527是否通过靶向调控miR-1253表达影响结直肠癌细胞的增殖、迁移及侵袭.

综合考虑后，汤国安等[11]设计了一种借助ArcGIS软件，利用欧氏区域分配提取面状河流中轴线的方法，该方法所提取的中轴线连续、光滑，且与相邻的线状支流保持有拓扑关系。但该方法在实际应用中存在一些局限性，对于较大的水系其面状河流的长宽比往往很大，河流最窄处的宽度相对于河流的长度非常小，因而在欧氏距离变换前选取变换分辨率时很难同时兼顾。实际提取运算中会出现无法有效栅格化面状河流边界线的情况最终导致方法失效的问题，在实际运用受到了较大限制。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2020-03/2020-08本院收治的经病理学诊断确诊为41例结直肠癌患者,癌组织及其癌旁组织标本,置于-80 ℃超低温冰箱内保存.女20例,男21例,年龄(50-68)岁,平均年龄(56.32±4.19)岁.

人结直肠癌细胞SW620(美国ATCC);Trizol试剂、Lipofectamine™ 3000转染试剂(美国Invitrogen);反转录与荧光定量PCR试剂盒(北京天根生化);si-NC、sicirc_0000527、miR-NC、miR-1253 mimics、pcDNA、pcDNA-circ_0000527、anti-miR-NC、anti-miR-1253(上海吉玛);CCK-8试剂盒(北京索莱宝); Matrigel基质胶(美国BD);Transwell小室(美国Corning);兔抗人E-cadherin、N-cadherin抗体、GAPDH(美国Abcam);二抗(北京中杉金桥生物).

1.2 方法

1.2.1 实验分组:将miR-NC、miR-1253 mimics、si-NC、si-circ_0000527分别转染至SW620细胞,分别记为miRNC组、miR-1253组、si-NC组、si-circ_0000527组.采用脂质体转染法将si-circ_0000527和anti-miR-NC、si-circ_0000527和anti-miR-1253分别共转染至SW620细胞,分别记为si-circ_0000527+anti-miR-NC组、sicirc_0000527+anti-miR-1253组.

1.2.2 qRT-PCR检测circ_0000527、miR-1253的表达水平:采用Trizol试剂分别提取癌旁组织、结直肠癌组织与SW620细胞总RNA.应用紫外分光光度计测定RNA浓度.反转录合成cDNA.qRT-PCR扩增反应体系:cDNA 2 μL,Real-Time Master Mix 10 μL,正反向引物各1 μL,RNase-Free ddH

O补足体系至20 μL;反应条件:95 ℃ 2 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,72 ℃ 30 s(循环40次).应用ABI StepOnePlus荧光定量PCR仪检测circ_0000527、miR-1253相对表达量.

液体冷却介质对不同温度下玉米种子发芽率有较大影响。在6种温度下，利用液体冷却介质处理玉米种子3 d，X1，F6，S10和H4的4 d平均发芽率较未处理的对照组发芽率分别有所下降，H1和K17的4d平均发芽率均高于对照组，除-25℃处理外，其余温度处理的S10发芽率均低于对照组发芽率（见图1）。S23，H1及K16经6种温度液体冷却介质处理后的7 d平均发芽率均明显高于对照组，F6号和S23在-10℃液体冷却介质处理后发芽率最高，其余则是在-20～-30℃经液体冷却介质处理后达到最高（见图2）。

1.2.3 CCK-8实验检测细胞增殖:各组SW620细胞接种于96孔板,每孔加CCK-8 10 μL,培养2 h,应用酶标仪检测各孔在450 nm处的光密度值(OD).

1.2.4 平板克隆形成实验:取各组SW620细胞接种于6孔板(500个/孔),于培养箱内培养直至出现肉眼可见的细胞克隆团,每隔2 d更换一次培养基,弃培养基,预冷PBS洗涤,加入500 μL甲醇固定20 min,加入400 μL 1%结晶紫染色液染色15 min,蒸馏水洗涤后晾干,拍照并观察细胞克隆形成数.

1.2.5 划痕实验:收集各组SW620细胞接种于6孔板(2×10

个/孔),于培养箱内培养直至细胞长满,用200 μL移液枪枪头在细胞单层划一道痕,于显微镜下拍照并记录(0 h),于培养箱内培养24 h后取出6孔板后再次于显微镜下拍照,应用ImageJ软件检测各组细胞迁移距离并计算细胞划痕愈合率[0 h划痕宽度-24 h划痕宽度/0 h划痕宽度×100%].

1.2.6 Transwell实验检测细胞侵袭:取Matrigel基质胶稀释液加入小室的上室(40 μL/孔),于培养箱内固定5 h,收集各组SW620细胞接种于上室(1×10

个/孔),下室加入600 μL含有10%胎牛血清的培养液,于培养箱内培养48 h,弃培养液,PBS洗涤,加入500 μL 4%多聚甲醛固定20 min,1%结晶紫染色液染色10 min,PBS洗涤后晾干,于显微镜下统计侵袭细胞数.

1.2.7 双荧光素酶报告实验检测circ_0000527与miR-1253的靶向关系:美国Promega公司构建野生型载体WT-circ_0000527和缺失miR-1253结合区域的突变型载体MUT-circ_0000527,采用脂质体转染法将miR-NC/WT-circ_0000527、miR-NC/MUT-circ_0000527、miR-1253 mimics/WT-circ_0000527、miR-1253 mimics/MUTcirc_0000527共转染至SW620细胞,培养24 h后收集细胞并检测细胞相对荧光素酶活性.采用脂质体转染法将pcDNA、pcDNA-circ_0000527、si-NC、si-circ_0000527分别转染至SW620细胞,培养48 h后收集细胞,用qRTPCR法检测miR-1253的表达量.

1.2.8 Western blot检测E-cadherin、N-cadherin蛋白表达量:PBS洗涤各组SW620细胞后加入400 μL RIPA裂解液提取细胞总蛋白,采用BCA法检测蛋白浓度.每孔道加入40 μg蛋白进行SDS-PAGE,将分离的蛋白凝胶转移至PVDF膜,用5%脱脂牛奶室温封闭PVDF膜2 h,分别加入E-cadherin(1:1000)、N-cadherin(1:1000)一抗与内参GAPDH抗体(1:2000)稀释液,4 ℃孵育24 h,TBST洗涤,加入1:3000稀释的二抗后,37 ℃孵育2 h,滴加ECL,暗室内曝光显影,应用Quantity One软件对蛋白条带进行定量.

采用SPSS 21.0统计学软件分析数据,计量资料以(mean±SD)表示,两组间比较采用独立样本

检验,多组间比较采用单因素方差分析,多组间两两比较可用LSD检验,以

＜0.05为差异具有统计学意义.

段文瀚解释说，第一个“绿色”之所以叫“绿色矿山”，是因为云天化采用最先进、效率最高的开采技术，极大提高了对磷矿石的利用率，做到了对资源的充分利用和循环利用。除此之外，云南的磷矿大都是胶磷矿，杂质含量较多，这就需要采用先进的浮选技术对胶磷矿进行加工，使其更干净、有害因子更少。同时，矿产开采完之后，云天化还会对土壤进行回填，利用先进技术进行浮土植被的种植。浮土植被的种植听起来简单，实际上对技术有很高的要求，前期投入巨大。据段文瀚介绍，上个世纪80年代至今，云天化单是复垦植被，恢复绿色的投入就将近10亿元，目的就是希望从源头支撑整个绿色发展理念的运行。

2 结果

2.1 circ_0000527和miR-1253在结直肠癌组织中的表达结直肠癌组织中circ_0000527的表达量高于癌旁组织(

＜0.05),miR-1253的表达量低于癌旁组织(

＜0.05),表1.

2.3 干扰circ_0000527表达对结直肠癌SW620细胞迁移、侵袭的影响 转染si-circ_0000527可降低划痕愈合率、侵袭细胞数,促进E-cadherin表达,抑制N-cadherin表达(

＜0.05),见图2、表3.

2.4 circ_0000527靶向调控miR-1253的表达 circ_0000527序列中与miR-1253存在互补核苷酸序列,图3.与miR-NC组相比,miR-1253降低WT-circ_0000527荧光素酶活性(

＜0.05),表4.circ_0000527可负向调节miR-1253表达(

＜0.05),表5.

综上所述，国内尿素走势并不如意，开工率下滑利好不断被业内炒作，或已透支；所谓的印度招标利好也不及预期。不可否认，当前行业低开工局面确实给低库存或零库存的尿素企业提供了挺价筹码，但内需疲软，暂时不允许工厂去考虑“货紧价扬”。换而言之，或许淡储期间的供应量不及往年水平，下游经销商库存量偏低，但并不能改变此时下游对高价尿素的不认可。当然，不排除众多经销商在本轮尿素跌价期间等待新的抄底机会，但相应心理价位仍需进一步博弈。预计11月底，国内尿素主产区报价2000元/吨左右。

1.2 Stroop色词测试 其由Stroop[8]编制，是广泛运用的视觉任务研究执行功能的典范之一。测试包括卡片A、B、C，卡片A写上黑色的随机排列的红、绿、黄、蓝；卡片B采用4种不同于字的颜色写上红、绿、黄、蓝；卡片C采用红、绿、黄、蓝色圆点。进行不同的测查完成所需的时间进行评分。该测验反映认知控制、目标保持以及在不熟悉刺激中习惯性应答的抑制能力。

2.5 miR-1253过表达对结直肠癌SW620细胞增殖、迁移、侵袭的影响 转染miR-1253 mimics可减弱SW620细胞OD值、克隆形成、划痕愈合率、侵袭细胞数,并可促进E-cadherin表达,抑制N-cadherin表达(

＜0.05),图4、表6.

3 讨论

circRNA是通过反向剪接形成的一种闭合环状结构,其不易被核酸外切酶降解,circRNA具有稳定性与保守性,circRNA可调控结直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭等生物学行为

.circRNA与miRNA竞争性结合而调控基因表达从而参与结直肠癌发生及发展过程,并可能作为结直肠癌靶向治疗的潜在靶点

.

本研究结果显示,结直肠癌组织中circ_0000527的表达量上升.circ_0000527在视网膜母细胞瘤组织和细胞中高表达,过表达circ_0000527可促进视网膜母细胞瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制细胞凋亡

.circ_0000527在视网膜母细胞瘤细胞中表达上调,并可通过充当miR-646的海绵分子而促进BCL-2表达从而促进视网膜母细胞瘤细胞增殖、迁移及侵袭

.本研究结果显示,干扰circ_0000527表达可降低结直肠癌细胞活力,细胞克隆形成数减少,提示干扰circ_0000527可抑制结直肠癌细胞增殖及克隆形成.间充质细胞标志物N-cadherin与上皮细胞标志物E-cadherin是上皮-间质转化(epithelialmesenchymal transition,EMT)的主要标志物,EMT转化可促使迁移及侵袭发生

.本研究结果显示,干扰circ_0000527可降低结直肠癌细胞划痕愈合率、侵袭细胞数,并可下调N-cadherin表达,上调E-cadherin表达,提示干扰circ_0000527表达可抑制结直肠癌细胞迁移及侵袭,其作用机制与调节EMT有关.

Circular RNA Interactome预测显示circ_0000527与miR-1253可能存在靶向调控关系,miR-1253在结直肠癌中发挥抑癌基因作用,circ_0000527/miR-1253轴是否可参与结直肠癌发生发展过程尚需进一步阐明.

由于我国行政事业单位财务缺乏管理,易造成预算编制的不科学不合理，出现多预算或者少预算情况，同时，也容易造成资金去向不明，其对于人民而言都是不负责任的行为。

4 结论

综上所述,circ_0000527可竞争性结合miR-1253,干扰circ_0000527表达可通过上调miR-1253表达而抑制结直肠癌细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭,circ_0000527/miR-1253分子轴在结直肠癌发生及发展过程中可能发挥重要调控作用.

2.2 干扰circ_0000527表达对结直肠癌SW620细胞增殖的影响 转染si-circ_0000527可降低细胞增殖、克隆形成能力(

＜0.05),见图1、表2.

可以看出，不同粗糙度下材料表面的BRDF在镜反射方向出现峰值，且随着表面粗糙度增大，镜反射方向附近BRDF峰形由陡峭逐渐趋于平缓。说明随着粗糙度的增大，漫反射占反射能量的比重增加，镜反射特性减弱，这是由于当表面粗糙度较小时，多数光子被直接反射到镜反射方向及其附近区域，表现出较强的镜反射；当表面粗糙度较大时，光子在粗糙表面会经历多次散射，导致镜反射特征减弱，漫反射特性增强。

circRNA可参与结直肠癌发生发展过程,可作为结直肠癌诊断、治疗靶点,并调控miRNA表达进而调节结直肠癌细胞生物学行为,目前circ_0000527对结直肠癌细胞生物学行为的影响尚未可知.

干扰同阻滞一样，可发生在心脏传导系统的不同层面——可发生在一个层面，也可同时发生于数个层面;根据程度也可分为一度、二度、高度和三度。如果干扰仅发生于一个心搏，则称为干扰现象；如连续发生于3个心搏以上，则称为干扰性脱节(图6)。干扰的心电图表现有时可见;有时也呈隐匿性，此时称为隐匿性传导;有时干扰还可引起一次新的干扰，从而使心电图表现复杂化。

本研究证实circ_0000527与miR-1253存在靶向调控作用,circ_0000527可通过吸附miR-1253而发挥作用.研究表明

,miR-1253在非小细胞肺癌组织中下调表达,上调其表达可抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭.miR-1253在非小细胞肺癌中表达水平降低,上调其表达可抑制非小细胞肺癌细胞增殖及转移

.miR-1253过表达可抑制乳腺癌细胞生长

.本研究结果显示,结直肠癌组织中miR-1253的表达量低于癌旁组织,下调miR-1253表达可降低干扰circ_0000527表达对结直肠癌细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭的抑制作用.提示circ_0000527可通过负向调控miR-1253表达影响结直肠癌细胞结直肠癌的发展进程.

2.6 下调miR-1253表达逆转了干扰circ_0000527表达对结直肠癌SW620细胞增殖、迁移、侵袭的作用 共转染si-circ_0000527、anti-miR-1253可逆转si-circ_0000527对SW620细胞生物学行为的作用(

＜0.05),见图5、表7.

circ_0000527通过靶向调控miR-1253表达影响结直肠癌细胞的增殖、迁移及侵袭.

综上所述，随着媒介融合时代的到来，新闻受众和新闻生产者之间的界限变得越来越模糊，这一现象的存在不仅仅给新闻编辑带来了严峻的挑战，同时也是一种机遇。要想更好地抓住这次机遇和应对这些挑战，要求新闻编辑准确地做好自我定位，不断提升自身素养，努力成为媒体融合时代中合格且优秀的传媒人才。

即把不在园林空间中的元素包含到园林空间中来，使得园林意境更添一份深意。由于园林建造在城市中，园林的场地是很有局限性的，要通过渗透和延伸园林空间来丰富园林空间和意境。借景的方法主要有近借、远借、互借等［2］。

qRT-PCR法检测结直肠癌患者的癌组织及其癌旁组织标本中circ_0000527、miR-1253的表达量;将人结直肠癌细胞SW620分为si-NC组、si-circ_0000527组、miR-NC组、miR-1253组、si-circ_0000527+anti-miR-NC组、sicirc_0000527+anti-miR-1253组;CCK-8、平板克隆形成、划痕实验、Transwell实验检测增殖、克隆形成、迁移和侵袭;双荧光素酶报告实验检测circ_0000527与miR-1253靶向.

结直肠癌组织中circ_0000527上调表达,miR-1253下调表达,抑制circ_0000527或miR-1253过表达可减弱细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力,证实circ_0000527可靶向调控miR-1253表达,下调miR-1253表达可减弱抑制circ_0000527表达对细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力的抑制作用.

circ_0000527表达可通过抑制miR-1253表达而促进结直肠癌细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭.

circ_0000527/miR-1253可能作为结直肠癌分子靶向治疗的潜在靶点.

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