黎仁玲 谢爱泽* 吕军影
1 广西医科大学,南宁市 530021;2 广西医科大学第一附属医院中医科,南宁市 530021
卒中相关性肺炎(stroke-associated pneumonia,SAP)是指非机械通气的卒中患者在卒中发病后7 d内新出现的肺炎[1],常伴有发热、呼吸困难、咳嗽、咳痰等临床症状,是卒中后最常见的并发症之一。英国一项纳入9238名卒中患者的大型队列研究表明SAP的发生率为11.7%,SAP不仅增加患者的死亡风险、延长住院时间,还会影响患者预后[2]。建立合适的动物模型是研究SAP发生发展过程与治疗方法的重要手段。目前关于SAP动物模型的建立方法尚无统一标准,学界仍在积极探索。胃肠功能障碍是脑卒中患者的又一常见并发症,主要表现为腹胀、腹泻、便秘、营养不耐受等,严重影响患者的心理健康与疾病预后。王小波[3]的临床研究发现,便秘与SAP的发生发展及预后密切相关,通腑中药能有效地改善SAP患者临床症状,但其作用机制尚不明确。本研究采用线栓法结合气管注射铜绿假单胞菌法建立SAP大鼠模型,观察SAP大鼠的胃肠动力和肠道病理变化,为进一步探究SAP胃肠功能障碍机制和改善SAP胃肠动力提供参考。
1.1 材料
1.1.1 实验动物 无特定病原体级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠12只,7~8周龄,体质量(280±20)g,由广西医科大学实验动物中心提供,实验动物生产许可证号:SCXK(桂)2014-0002。所有大鼠在干预前适应性饲养3 d:广西医科大学实验动物中心,20~25 ℃,相对湿度为45%~65%,12 h黑暗与12 h光照循环以模拟正常昼夜周期,自由饮水进食。实验方案及操作经广西医科大学动物实验委员会审查批准(编号:202009023),符合实验动物伦理学要求。动物使用许可证号:SCXK(桂)2014-0003。
1.1.2 实验菌株 铜绿假单胞菌标准菌株[编号:CMCC(B)10104]购于上海鲁微科技有限公司。经常规方法复苏培养后,用无菌生理盐水配制浓度为4×108CFU/mL的铜绿假单胞菌细菌悬液。
1.1.3 主要实验材料、试剂与仪器 大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO )线栓(规格:L3600)购自广州佳灵生物技术有限公司;2%氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色液购自北京索莱宝科技有限公司;HE染色试剂来自广西医科大学免疫组化实验室;Olympus正置四色荧光显微镜(日本Olympus公司,型号BX53)。
1.2 方法
1.2.1 动物分组与造模 将12只雄性SD大鼠随机分为假手术组和模型组,每组6只。模型组大鼠采用线栓法结合气管注射铜绿假单胞菌法建立SAP模型:吸入浓度为3%~4%流速为0.6~0.8 L/min的异氟烷诱导大鼠麻醉,然后将大鼠以仰卧位固定于无菌操作台上,吸入浓度为1%~2%流速为0.6~0.8 L/min的异氟烷维持大鼠麻醉。颈部备皮、消毒、铺巾,于颈部正中偏右侧纵向切开皮肤1.5 cm,钝性分离暴露右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉;用丝线结扎颈总动脉近心端、颈外动脉近心端,另取丝线悬拉阻断颈内动脉血流,在距离颈总动脉分叉处5 mm的血管壁上横向剪开一小切口;用镊子夹取线栓从切口缓慢插入,同时放松悬拉的丝线并缓慢推入线栓约2 cm,使线栓头端到达大脑中动脉起始处,以有抵触感为度,固定线栓并剪去多余线栓及丝线;分离气管,用1.0 mL注射器注入0.2 mL铜绿假单胞菌悬液,注入后将大鼠竖立30 s并左右均匀摆动,使细菌悬液均匀分布于两肺;消毒、逐层缝合手术切口。假手术组大鼠操作步骤同模型组,结扎颈动脉后不插入线栓,不注入铜绿假单胞菌悬液。
1.2.2 观察大鼠一般状态 造模后24 h时,比较两组大鼠的状态、被毛、活动度、呼吸、鼻周分泌物、粪便等一般情况,记录体质量与体温。
1.2.3 神经功能缺损评分 造模后24 h时采用Longa评分法对两组大鼠进行神经功能缺损评分。无神经功能缺陷症状,计0分;轻度神经功能缺陷,不能完全伸展手术对侧前爪,计1分;中度神经功能缺陷,向手术对侧转圈,计2分;重度神经功能缺陷,向手术对侧倾倒,计3分;意识昏迷或者不能行走,计4分。分数越高表示大鼠神经功能缺损越严重。
1.2.4 胃肠动力检测 完成神经功能缺损评分后,处死大鼠前给予黑色半固体(0.5%羧甲基纤维素钠 ∶碳素墨水比例为9 ∶1混合物)2 mL灌胃,20 min后用异氟烷诱导麻醉大鼠,麻醉成功后用组织剪沿腹正中线剪开,暴露腹腔,用丝线结扎胃贲门、幽门与盲肠末端,迅速分离胃贲门至盲肠末端组织。轻轻分离肠系膜后展开胃肠组织,测量幽门至黑色半固体前沿的距离及幽门至回肠末端的距离。剪下从贲门及幽门处的胃组织称量胃总重,用生理盐水洗净胃内容物后称量胃净重。胃残留量=胃总重-胃净重。小肠推进率=幽门至黑色半固体前沿的距离/幽门至回肠末端的距离×100% 。
1.2.5 肺组织匀浆铜绿假单胞菌培养 用灭菌组织剪剪开大鼠胸部,取大鼠的右肺上叶,称重后使用组织研磨机进行研磨获取匀浆,用无菌生理盐水稀释10倍得到匀浆液,取20 μL匀浆液涂于普通营养琼脂固体培养基上,于37℃恒温培养箱孵育培养48 h,观察菌落生长情况。
1.2.6 肺、结肠组织HE染色 选取大鼠的右肺下叶及盲肠下约1 cm处的结肠组织浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定48 h以上,将固定好的组织制作石蜡包埋、切片、苏木精- 伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色,通过显微镜观察组织病理学变化。
1.2.7 脑组织TTC染色 取完上述组织后,两组分别随机选取3只大鼠取脑组织行TTC染色。方法如下:断头取脑组织于-20℃冰冻30 min;将冰冻脑组织冠状位切成2 mm厚片,将切片浸泡于2% TTC染色液中,37℃避光孵育30 min;取出染色好的脑组织切片于4%多聚甲醛溶液中固定6 h;取出固定好的脑组织切片排列拍照保存。正常组织被染成红色,脑梗死区不被染色。
1.2.8 脑组织HE染色 两组余下3只大鼠取脑组织行HE染色。方法如下:游离心脏,剪开左心室一小口插入灌注针并固定,作为灌注液注入口,剪开右心耳作为灌注液流出口,夹闭胸、腹主动脉;经灌流针快速灌注4℃生理盐水200 mL,直到右心耳流出液澄清,再快速灌注4℃ 4%多聚甲醛溶液200 mL;断头取脑组织浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定48 h以上,将固定好的组织制作石蜡包埋、切片、HE染色,通过显微镜观察脑组织病理改变。
1.3 统计学分析 采用SPSS 24.0统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以x±s表示,两组间比较采用独立样本t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 两组大鼠一般状态的比较 造模后24 h时,假手术组大鼠一般状态良好,被毛平顺有光泽,活动灵敏,呼吸平顺,鼻头湿润干净;模型组大鼠状态差,被毛乱而无光泽,活动明显减少,呼吸急促,打喷嚏,鼻周有大量分泌物。造模后24 h时,模型组大鼠体重为(239.333±3.204)g,轻于假手术组大鼠体重(281.833±6.369)g(t=14.601,P<0.001);模型组大鼠体温为(39.02±0.42)℃,高于假手术组大鼠体温(37.95±0.33)℃(t=4.897,P=0.001)。
2.2 两组大鼠神经功能缺损评分的比较 造模后24 h时,模型组大鼠的神经功能缺损评分为(2.50±0.55)分,高于假手术组大鼠的神经功能缺损评分(0分)(t=11.180,P<0.001)。
2.3 两组大鼠胃肠动力情况的比较 模型组大鼠的胃残留量为(1.258±0.342)g,假手术组大鼠的胃残留量为(0.862±0.422)g,差异无统计学意义(t=1.789,P=0.104)。模型组大鼠的小肠推进率为(50.2±5.1)%,低于假手术组的(67.5±7.4)%(t=4.703,P=0.001)。
2.4 两组大鼠肺组织匀浆培养结果的比较 假手术组大鼠的肺组织匀浆培养后未见菌落生长;模型组大鼠的肺组织匀浆培养后可见培养基呈典型的蓝绿色,培养基表面见扁平湿润、边缘不整齐的菌落生长,经广西医科大学微生物学实验室鉴定为铜绿假单胞菌菌落。见图1。
假手术组 模型组
2.5 两组大鼠脑组织TTC染色结果的比较 假手术组大鼠未见脑梗死灶,模型组大鼠可见明显缺血性梗死灶,以皮层梗死为主。见图2。
假手术组 模型组
2.6 两组大鼠脑组织病理学的比较 假手术组大鼠脑组织可见大部分神经元分布均匀,结构清晰,细胞无显著肿胀或皱缩,间质均匀,无炎性细胞浸润。模型组大鼠脑组织结构疏松,神经元数量明显减少,分布不均,细胞间隙增大,细胞皱缩,结构模糊,炎性细胞浸润。见图3。
假手术组 模型组
2.7 两组大鼠肺组织病理学的比较 假手术组大鼠肺组织结构完整,肺泡轮廓清晰,肺泡腔干净无渗出,肺间质无出血、水肿、炎性细胞浸润。模型组大鼠肺组织以细支气管为中心发生实变,肺泡轮廓隐约可见,肺泡腔内可见大量红细胞渗出,肺间质水肿、增厚、大量炎性细胞浸润。见图4。
假手术组 模型组
2.8 两组大鼠结肠组织病理学的比较 假手术组大鼠结肠黏膜上皮层细胞完整、排列整齐,黏膜固有层腺体结构清晰,杯状细胞丰富,黏膜下层少见或无炎性细胞浸润。模型组大鼠结肠黏膜上皮层细胞缺失,固有层腺体排列紊乱,可见较多炎性细胞与红细胞浸润,黏膜下层可见血管增生。见图5。
假手术组 模型组
我国国家卒中登记中心的资料显示缺血性卒中患者的SAP发生率为11.4%[4]。研究认为SAP与卒中诱导的免疫抑制、吞咽困难、误吸、细菌定植等因素相关,是卒中患者重要的致死原因之一[5-7]。除了根据病原菌培养结果选择敏感的抗生素外,中医药在改善SAP患者症状中发挥了重要作用,但其作用机制仍不明确。动物模型为探讨中医药治疗SAP的作用机制提供了良好的条件,但目前学界尚无关于SAP动物模型建立的统一标准。现有研究中SAP动物模型的建立方法主要有线栓法结合气管注射细菌法、线栓法结合细菌滴鼻法、线栓法自发细菌感染,以及四动脉阻断法自发肺部感染等[8-11]。线栓法是目前较为成熟的建立MCAO模型的方法,本课题组前期探索发现,脑梗死SD大鼠在SPF级环境中并未出现自发生肺部感染,而线栓法结合细菌接种可以确保每只大鼠模型均能感染一定数量的外来细菌,因而能较好地建立大鼠肺部感染模型。在此基础上,我们比较线栓法分别结合细菌滴鼻法、经口腔气管插管法和气管注射细菌法建立的SAP模型,认为线栓法结合气管注射细菌法建立SAP大鼠模型可控性好、成功率最高,且操作简便、可重复性好[12]。
本实验使用线栓法结合气管注射铜绿假单胞菌法建立SAP大鼠模型,大鼠出现神经功能障碍,对侧肢体偏瘫,脑组织TTC染色和HE染色可见明显的缺血和坏死,提示线栓法成功使大鼠发生脑卒中;肺组织匀浆铜绿假单胞菌培养阳性、HE染色可见典型肺实质病变,提示气管注射铜绿假单胞菌法成功建立了肺部感染模型。造模后24 h时模型组大鼠出现体温升高、鼻周分泌物增多、呼吸喘促等症状,表示成功模拟了脑卒中患者急性期并发肺部感染的临床症状,且这些症状符合中医学痰热证的证候特点,这为研究清热化痰药治疗SAP患者的作用机制提供了一定的参考依据。
脑卒中患者常并发胃肠功能紊乱,康复机构的脑卒中患者便秘的发生率高达80%[13]。研究认为脑肠之间存在包括肠道菌群在内的脑肠轴,即大脑的病变可能通过神经、免疫、微生态等途径影响肠道的生理病理过程[14]。在本研究中,模型组大鼠胃肠动力受到影响,其中小肠推进率较假手术组大鼠明显降低(P<0.05);两组大鼠胃残留量差异虽无统计学意义,但模型组胃残留量稍高于假手术组,提示模型组大鼠存在胃肠动力的减退。此外本研究通过HE染色观察到模型组大鼠的结肠组织出现炎性浸润、结构破坏等病理改变,提示模型组大鼠肠道屏障受损。中医学认为“肺与大肠相表里”,肺与大肠在经络上互为表里,肺病经过传变也会影响大肠的生理功能。肺为气之主,肺气的宣发与肃降会影响全身气机,肺气的宣发肃降失常则影响大肠的气化传导。肺主通调水道,与大肠主津相辅相成,水液输布失常则津亏肠燥或下利泄泻。因此SAP模型大鼠出现胃肠动力减退,除了与大脑的病变有关,还可能与中医学之经脉络属、气机升降失常和水液输布代谢相关[15]。关于并发肺部感染是否进一步加重了脑梗死大鼠的胃肠功能障碍,未来我们将进一步通过实验进行验证。
综上所述,本研究采用线栓法结合气管注射铜绿假单胞菌法建立的SAP模型能较好地模拟临床SAP患者,且该模型大鼠出现明显的肠道病理改变和胃肠动力减退,为SAP胃肠功能障碍的研究奠定了良好的基础。