黄牛肝菌多酚的提取工艺优化及其抗氧化作用研究

刘 坤，郭 彤，王晓彬，程 华，李 娜，殷九一，戚翠莲

（1.河北经贸大学数学与统计学院，河北 石家庄 050061；2.河北经贸大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050061；3.天津科技大学生物工程学院，天津 300450；4.河北省科学院生物研究所，河北 石家庄 050081）

多酚是植物体内重要的次级代谢产物[1]，在植物的生长发育、基因表达和信号传导都有很大的作用。有研究表明，植物多酚具有抗菌[2-3]、控制血糖[4]、增强抗癌化疗药物的治疗效率[5]等方面有一定作用。黄牛肝菌（Boletus speciosus），也称作松蘑或者黄花松茸，是一种可食用真菌[6]，富含多糖、甾类、酚酸类及各种色素等成分[7-8]，具有较高的营养价值与药用价值[9-11]。目前，对于黄牛肝菌多酚类物质提取工艺及优化的研究较少，采用单因素试验和响应面试验优化黄牛肝菌多酚的提取工艺，并检测其抗氧化活性，为今后黄牛肝菌的进一步研究和利用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄牛肝菌，购自云南省丽江；没食子酸（分析纯），上海金穗生物技术有限公司提供；钨酸钠，天津市源东化学试剂有限公司提供；钼酸钠（分析纯），天津市福辰化学试剂厂提供；硫酸锂（分析纯），南京金留化玻仪器有限责任公司提供；双氧水、无水乙醇（分析纯），瑞康医用科技有限公司提供；磷酸、碳酸钠（分析纯），天津市北辰方正试剂厂提供；无水硫酸钠（分析纯），国药集团化学试剂有限公司提供；浓盐酸（分析纯），天津市大茂化学试剂厂提供；总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS 法），上海碧云天生物技术有限公司提供。

1.2 主要仪器

XFB-1000 型中药粉碎机，吉首市中诚制药机械厂产品；722 型分光光度计，上海析谱仪器有限公司产品；KQ-500DB 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；HH-6 型数显恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司产品；电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司产品；TDL-60B 型台式离心机，上海安亭科学仪器厂产品。

1.3 试验方法

1.3.1 福林酚试剂的配制

根据程启斌等人[12]的方法配制福林酚试剂，于4 ℃冰箱中保存备用。

1.3.2 标准曲线的绘制

取10 mg 没食子酸标准品蒸馏水溶解，置于100 mL 的容量瓶，定容得质量浓度0.1 mg/mL 的标准溶液。分别量取标准溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL 于10 mL 棕色容量瓶中，加超纯水补充至2 mL，摇匀后分别加入1 mL 的福林酚试剂，2 min 后各加入2 mL 10%碳酸钠溶液，混匀，用蒸馏水将其定容，在50 ℃水浴加热黑暗条件下反应15 min，于波长765 nm 处测定吸光度。以标准液质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，其线性方程为Y= 14.306X+0.017 6（R2=0.999 4），后续用每克黄牛肝菌没食子酸当量计算多酚含量。

1.3.3 样品中多酚的测定

准确吸取2 mL 样品溶液，分别加入1 mL 福林酚试剂，质量分数为10%的碳酸钠溶液2 mL，蒸馏水定容至10 mL 后于50 ℃水浴中进行15 min 暗反应，冷却后于波长765 nm 处测定吸光度。

1.4 单因素试验

1.4.1 料液比对多酚提取量的影响

准确称取0.1 g 黄牛肝菌粉末，按1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 的料液比溶于体积分数45%乙醇中，于35 ℃下超声提取30 min ，探究不同料液比对多酚提取量的影响。

1.4.2 乙醇体积分数对多酚提取量的影响

准确称取0.1 g 黄牛肝菌粉末，在料液比1∶10（g∶mL） 下分别溶解于体积分数35%，45%，55%，65%乙醇中，于35 ℃下超声提取30 min，探究不同乙醇体积分数对多酚提取量的影响。

1.4.3 超声时间对多酚提取量的影响

准确称取0.1 g 黄牛肝菌粉末，按1∶40 的料液比溶于45%乙醇中，分别于35 ℃下超声提取20，25，30，35，40 min，探究不同超声时间对多酚提取量的影响。

1.4.4 超声温度对多酚提取量的影响

准确称取0.1 g 黄牛肝菌粉末，按1∶40 的料液比溶于45%乙醇中，分别在30，35，40，45，50 ℃下超声提取30 min，探究不同超声温度对多酚提取量的影响。

1.4.5 提取次数对多酚提取量的影响

准确称取0.1 g 黄牛肝菌粉末，在料液比1∶10下溶解于45%乙醇中，在35 ℃超声30 min 下分别提取1，2，3 次，探究不同提取次数对多酚提取量的影响。

1.5 响应面试验

在单因素试验的基础上，以料液比、乙醇体积分数、超声时间为影响因素，多酚提取量为响应值，根据Box-behnken 模型进行响应面试验设计。

响应面试验自变量因素水平见表1。

1.6 抗氧化试验

1.6.1 DPPH 自由基清除试验

取定量DPPH 于试管中，分别加入不同质量浓度（200.00，100.00，50.00，25.00，12.50，6.25 μg/mL）维C 和样品溶液暗反应30 min 后，于波长517 nm下测定吸光度。自由基清除率的计算公式如下[13]：

式中：A1——空白吸光度；

A2——样品吸光度。

1.6.2 清除ABTS 自由基能力的测定

采用总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS 法），以trolox 为标准品作出标准曲线，其线性方程为Y=-1.509 4X+0.586 4（R2=0.993 7），后续用牛肝菌多酚提取物的吸光度计算其对ABTS 自由基的清除能力。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 料液比的影响

5种料液比下多酚提取量分别为8.813，10.359，10.478，10.624，10.079 mg/g，当料液比为 1∶40 时得到黄牛肝菌多酚提取的最优值。因此，选择料液比1∶40 为最佳料液比。

2.1.2 乙醇体积分数的影响

在不同乙醇体积分数下多酚提取量分别为8.521，9.092，8.736，7.841，7.755 mg/g，随着乙醇体积分数增加，多酚提取量先增加后降低，在45%乙醇时最高。所以，选择45%乙醇为最佳体积分数。

2.1.3 超声时间的影响

在不同超声时间下多酚提取量分别为9.415，9.780，10.168，9.929，9.157 mg/g，即超声时间为30 min 时多酚提取量最高。所以，超声时间定为30 min 进行下一步试验。

2.1.4 超声温度对提取黄牛肝菌中多酚的影响

不同超声温度下多酚提取量为8.049，8.257，6.884，7.503，7.384 mg/g，在35 ℃时多酚提取量最高。所以，后续试验在这个条件下进行。

2.1.5 提取次数对提取黄牛肝菌中多酚的影响

不同提取次数下多酚提取量分别为8.314，8.514，8.681 mg/g，3 次的结果差异不显著，从多酚提取量和经济效益的角度考虑，选择提取次数为1 次[14]。

2.2 响应面试验设计结果

响应面试验设计及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果

选取料液比（A）、乙醇体积分数（B） 和超声时间（C） 为变量，选定黄牛肝菌多酚提取量为响应值，通过软件进行拟合分析[15]，得到黄牛肝菌多酚提取量回归方程：

对于上述回归方程进行方差分析。

响应面方差分析结果见表3。

表3 响应面方差分析结果

由表3 可知，所建立模型的p＜0.01，差异极显著；失拟差p=0.309 8，差异不显著，表明模型可靠性较高，试验误差较小，因此可以对黄牛肝菌多酚提取量进行分析和预测[16]。其中，提取时间达到极显著水平，且乙醇体积分数、提取时间对多酚提取量的影响大于料液比。交互项AB 对结果影响显著；二次项A2，B2，C2对结果影响均极显著。

2.3 响应面分析

响应面图的倾斜程度越大，表明响应值对因素的变化越敏感。反之，表明响应值对因素的变化不敏感[17]。

两因素交互作用对多酚提取量影响的响应面曲线见图1。

由图1 可知，料液比、乙醇体积分数和提取时间与提取的多酚提取量存在一定相关性。经过Design Expert 8.0.6 软件对回归方程进行多次回归可知黄牛肝菌多酚最佳提取工艺为料液比1∶40.38，乙醇体积分数43.34%，超声时间28.43 min，在此最优条件下进行试验，黄牛肝菌多酚提取量为10.497 μgGAE/g，与理论值10.469 μg GAE/g 较为一致，验证了模型的可靠性。

图1 两因素交互作用对多酚提取量影响的响应面曲线

2.4 抗氧化活性

从DPPH 和ABTS 自由基清除活性2 个方面考查了黄牛肝菌多酚提取物的抗氧化活性。黄牛肝菌多酚提取物具有一定的DPPH 自由基清除活性，且DPPH 自由基的清除能力随着其浓度的增加而增加（图 2），其 IC50值为 53.64，与维 C 的 IC50值 4.05 差异显著（p＜0.05）。ABTS 自由基清除试验表明，黄牛肝菌多酚提取物样品对ABTS 自由基清除能力达到0.525 trolox mmol/mg。

清除DPPH 自由基能力见图2。

图2 清除DPPH 自由基能力

3 结论

在单因素试验基础上，通过响应面试验得到黄牛肝菌中多酚最优提取工艺为乙醇体积分数43.34%，料液比1∶40.38（g∶mL），超声提取时间28.43 min，在此工艺条件下黄牛肝菌多酚提取量为10.497 μg GAE/g。通过DPPH 自由基清除、ABTS 自由基清除试验表明，黄牛肝菌多酚提取液具有一定的抗氧化活性，为黄牛肝菌资源的开发和利用提供科学依据。