高盐胁迫对缢蛏幼贝存活和三种酶活性的影响

曹 伟, 迟长凤, 董迎辉, 毕斯琦, 刘志鸿, 孙秀俊, 周丽青, 吴 彪

高盐胁迫对缢蛏幼贝存活和三种酶活性的影响

曹 伟1, 2, 迟长凤1, 董迎辉4, 毕斯琦5, 刘志鸿2, 3, 孙秀俊2, 3, 周丽青2, 3, 吴 彪2, 3

(1. 浙江海洋大学 国家海洋设施养殖工程技术研究中心, 浙江 舟山 316022; 2. 中国水产科学研究院 黄海水产研究所 农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室, 山东 青岛 266071; 3. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室, 山东 青岛 266071; 4. 浙江万里学院 浙江省水产种质资源高效利用技术研究重点实验室, 浙江 宁波 315100; 5. 天津农学院 天津市水产生态及养殖重点实验室, 天津 300384)

为探讨高盐胁迫对壳长约2 cm缢蛏()幼贝存活和酶活性的影响, 本研究设置盐度分别为20‰(S20)、25‰(S25)、30‰(S30)、35‰(S35)、40‰(S40)和45‰(S45)6个组别胁迫缢蛏, 测定各组幼贝死亡率, 并计算不同胁迫时间的半致死盐度(LC); 同时研究了S20、S30和S40组幼贝软体部Na+-K+-ATP酶(NKA)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)三种酶在不同胁迫时间的活性变化特征。结果表明, 实验处理120 h后, 各组死亡率分别为0、(2.17±0.85)%、(9.50±0.82)%、(30.67±3.70)%、(73.50±7.08)%和(94.67±3.06)%, 168 h时S45组的缢蛏幼贝全部死亡; 直线内插法计算得到的72、96、120、144、168 h的高盐LC分别为46.03‰、39.85‰、35.77‰、34.57‰、33.69‰, 概率单位法得到的高盐LC分别为44.31‰、40.74‰、36.96‰、35.67‰、34.47‰。随着盐度升高和处理时间延长, NKA、AKP与ACP活性总体上呈现先上升再下降后稳定的趋势, 三种酶活性变化趋势相似, 但效应时间不同, 盐度高于30‰会给幼贝机体造成较大伤害, 能降低机体渗透压调节和免疫防御机能, 甚至导致死亡。研究结果为高盐条件下开展缢蛏科学养殖提供了参考数据。

缢蛏()幼贝; 高盐胁迫; 半致死盐度; 酶活性

盐度是重要的环境因子, 显著影响水生生物的生存生长、能量代谢、渗透调节、免疫防御等多种生物学过程[1-2]。由于全球变暖和人类活动的影响, 沿海生态环境因子经常发生变化, 给养殖生物带来不同程度的损伤[3-5], 甚至死亡。多数双壳贝类移动能力较差, 机体对于盐度变化的调节适应尤为重要。当水体盐度变化时, 水生动物体内的生理过程都会发生明显的适应性改变[6], 其中酶活力的变化可以有效反应机体变化状况。在这一过程中, Na+-K+-ATP酶(NKA)能够发挥稳定细胞内外渗透压平衡和驱动离子逆浓度梯度跨膜主动转运的作用[7-8], 其作用过程主要包括被动应激期、主动调节期、适应期[9]。碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)是生物代谢的重要免疫类酶, 是动物体内解毒体系的重要组成, 参与磷酸基团的转移反应以及体内能量的收支平衡[10], 是衡量机体免疫和健康状况的重要指标。凡纳滨对虾()[10]、三疣梭子蟹()[11]、近江牡蛎()[12]等多种广盐性海洋无脊椎动物均有酶活力相关研究的报道, 且发现NKA在离子调控中发挥重要作用, 而AKP和ACP在盐度胁迫时的变化可引起体内机能协调失常、免疫防御能力降低。

缢蛏()隶属于双壳纲、帘蛤目、竹蛏科, 常栖息于有淡水注入河口区的软泥底质中, 是我国传统的四大海水养殖贝类之一。目前, 池塘混养已成为缢蛏养殖的重要模式之一。海水池塘水环境相对封闭, 水环境因子变化较大, 尤其夏天, 干旱、高温等原因加速了蒸发速率, 会导致养殖池塘的海水盐度不断上升。同很多双壳贝类一样, 缢蛏的人工育苗和养殖也主要以室内育苗、室外中间培育和养成的分段式进行。一般情况下, 稚贝壳长超过600 μm可移到室外进行中间培育, 越冬后将中培后壳长2 cm左右的幼贝转移至池塘养成[13-14]。此时的幼贝需适应池塘新环境, 盐度的变化便是其中重要的一个因素, 研究幼贝在高盐胁迫下的生存及生理变化尤为重要。

缢蛏适应盐度范围为是4‰～28‰, 最适盐度范围是10‰～20‰, 蛏体大小不同, 对盐度的适应能力略有不同, 相对而言, 小蛏更耐淡, 大蛏更耐咸[15]。魁蚶()[16]、近江牡蛎[17]、菲律宾蛤仔()[18]等贝类盐度耐受性的研究结果表明, 成贝耐受盐度变化的能力普遍强于幼虫。林笔水等[19-21]也曾研究了不同盐度下缢蛏生存、生长及发育状况, 并发现长期生活在较高盐度海域的亲贝所繁衍的幼虫对高盐的耐受能力强于低盐耐受力, 但尚未见壳长2 cm规格幼贝的相关研究。本文拟通过研究高盐胁迫下壳长约2 cm缢蛏幼贝的死亡率和NKA、AKP、ACP酶活性的变化, 揭示幼贝在不同盐度环境下存活和生理适应变化情况, 为缢蛏池塘养殖、高盐新品种(系)培育提供基础数据。

1　材料与方法

1.1　实验材料

获取烟台莱阳群体野生缢蛏亲贝, 选择2 000粒壳长5 cm左右的缢蛏, 人工繁育子代并养殖至壳长约2 cm用于实验。实验前, 于实验室暂养7 d, 海水盐度20‰, 温度(20±1)℃, 每天投喂等鞭金藻()2次, 使水体中藻细胞浓度为2× 105cell·mL–1; 同时每天换水1次, 每次换水量为1/2。

1.2　实验方法

行为观察及存活实验: 实验设置6个盐度梯度, 分别为20‰(S20)、25‰(S25)、30‰(S30)、35‰(S35)、40‰(S40)、45‰(S45), 其中S20为对照组。每组设置3个平行, 每个平行200个个体。观察并记录幼贝行为状态, 统计幼贝在胁迫6、12、24、48、72、96、120、144、168 h共9个时间点的死亡个数, 计算死亡率, 并计算不同处理时间的半致死盐度LC。

酶活性实验: 利用NKA、AKP、ACP试剂盒测定S20、S30和S40幼贝在胁迫6、12、24、48、72、96、120 h后三种酶的酶活力。从各组中分别取5个幼贝的软体部用于NKA、AKP、ACP酶活力测定, 蛋白定量测定盒(A045-4)、NKA测试盒(A070-2)、AKP测试盒(A059-2)、ACP测试盒(A060-2)均购自南京建成生物工程研究所, 实验步骤按照试剂盒说明书进行。

1.3　数据处理

利用Excel 2019进行统计和作图分析, 采用SPSS 26通过直线内插法[22]和概率单位法[23]计算幼贝不同高盐胁迫时间的半致死盐度LC, Duncan进行差异显著性检验,<0.05时差异显著。

2　结果

2.1　高盐胁迫对缢蛏幼贝行为及存活的影响

在适盐条件养殖下(S20、S25组), 缢蛏始终保持旺盛活力, 水管伸出, 闭壳肌舒张, 水体清澈无异味; 在中、高盐度胁迫下(S30、S35组), 水管少部分伸出, 突然伸出斧足窜动的躁动现象频繁, 水体散发淡腥味; 在高盐度胁迫下(S40、S45组), 缢蛏水管不再伸出, 闭壳肌收缩, 双壳紧闭, 未有躁动现象, 水体易浑浊。

缢蛏幼贝经不同盐度处理后的死亡情况如图1所示。结果显示, 对照组始终没有出现死亡个体, 说明实验幼贝健康状况良好; 所有组的幼贝在胁迫6 h未有死亡, S45组在胁迫12 h后最先开始出现死亡, 各实验组死亡率随盐度升高和胁迫时间增长逐渐上升。同一时间点, 死亡率具有随盐度升高而升高的趋势。S25组与S30组实验期间死亡较少, 死亡率始终显著低于其他各高盐组(<0.05); S35组死亡率缓慢均匀上升; S40和S45组死亡情况严重, 死亡率快速上升。72 h后, 各实验组死亡率分别为(1.00±0.82)%、(3.33±0.85)%、(12.83±2.78)%、(32.00±3.34)%、(51.67± 4.09)%, 且S25组与S30组与其他各实验组两两之间均存在显著性差异(<0.05); 至120 h时, 各实验组死亡率分别达到(2.17±0.85)%、(9.50±0.82)%、(30.67± 3.70)%、(73.50±7.08)%和(94.67±3.06)%, 各实验组两两之间均存在显著性差异(<0.05); 168 h时S45组的缢蛏幼贝全部死亡。

图1 缢蛏幼贝在不同盐度、不同胁迫时间的死亡率

不同胁迫时间下, 缢蛏幼贝线性回归方程相关数据以及盐度LC如表1所示, 概率单位模型方程以及盐度LC如表2所示。结果表明, 高盐胁迫时间越长, 其半致死盐度越小。直线内插法计算所得幼贝在72、96、120、144、168 h的高盐度LC分别为46.03‰、39.85‰、35.77‰、34.57‰、33.69‰(表1); 概率单位法计算所得缢蛏幼贝在72、96、120、144、168 h的盐度LC分别为44.31‰、40.74‰、36.96‰、35.67‰、34.47‰(表2), 两种方法计算的缢蛏高盐LC结果相近, 表明结果可靠。

表1 直线内插法分析缢蛏幼贝半致死盐度

表2 概率单位法分析缢蛏幼贝半致死盐度

2.2　高盐胁迫对缢蛏幼贝3种酶活性的影响

酶活实验结果表明, 高盐对缢蛏幼贝的NKA活性存在明显影响(图2a)。对照组, 幼贝NKA活性在不同处理时间基本处于稳定状态, 无显著差异; S30组, 胁迫6 h后NKA活性显著上升(<0.05), 且达到最高值(7.20±0.75) U·mgprot–1, 活性约为对照组的150%, 随后活性快速回落并趋于稳定; 12 h内, S40组与S30组趋势相同, 但S40组24 h后显著上升, 在48 h达到最大值(7.08±0.24) U·mgprot–1, 也约为对照组的150%, 之后回落并趋于稳定。6 h时, S30和S40组NKA活力显著高于对照组(<0.05); 12 h和24 h时, S30组NKA活力显著低于对照组和S40组(<0.05), S40组与对照组没有显著性差异(>0.05); 48 h时, 对照组与S30组没有显著性差异(>0.05), 但两者都显著低于S40组(<0.05); 72 h时, 三组之间两两差异显著(<0.05), 且S30组活性最低, S40组活性最高; 96 h后, S30和S40组NKA活力显著低于对照组(<0.05)并在之后趋于稳定。

总体上, ACP活性呈现先升高后降低(图2b)。从图2b可以看出, 对照组ACP活性未有显著性变化; S30组, ACP活性总体较稳定, 96 h后ACP活性显著下降(<0.05)并稳定; S40组, ACP活性先上升, 12 h最高(约为对照组的170%), 之后下降, 并在96 h后与S30组活性相近。在同一时间点上, 12 h时, S40组ACP活性显著高于对照组和S30组(<0.05); 24、48和72 h时, S40组ACP活性显著低于对照组和S30组(<0.05); 96 h后, S30和S40组ACP活力显著低于对照组(< 0.05), 并在之后趋于稳定。

缢蛏幼贝在高盐胁迫下AKP活性变化见图2c。对照组AKP活性稳定; S30组自胁迫开始AKP活性就呈下降趋势, 在胁迫24 h时下降到最低(<0.05, 且活性约为对照组的60%), 之后活性开始上升至稳定; S40组在胁迫12 h时AKP活性有小幅升高(<0.05), 之后显著下降(<0.05), 48 h到达最小值(约为对照组的80%), 之后显著上升并稳定。胁迫6 h时, 实验组和对照组AKP活性无显著性差异(>0.05); 胁迫12 h和24 h时, S30、S40组、对照组两两之间差异显著(<0.05), 且S30组AKP活性最小, 但12 h时S40组活性最高, 24 h时对照组活性最高; 胁迫48 h时, 两个实验组之间差异不显著(>0.05), 但实验组活性显著低于对照组(<0.05); 72 h之后, 三组之间差异不显著(>0.05)。

图2 急性高盐胁迫对缢蛏幼贝三种酶活力的影响

注: (a), NKA活性; (b), ACP活性; (c), AKP活性。图中不同大写字母代表同一时间下不同盐度组间的表达差异(<0.05), 不同小写字母代表同一盐度组不同时间下的表达差异(<0.05)。

3　讨论

3.1　高盐对缢蛏幼贝存活状态的影响

缢蛏属于广盐适应种, 适应盐度范围为是4‰～ 28‰, 主要分布于河口地区。河口区水环境理化因子变化较大, 尤其是盐度的变化较为突出, 而盐度的骤变会引起机体相应的应激反应[24], 影响生理状态和存活。前期的研究结果表明, 缢蛏幼虫(壳长约130 μm)适盐范围为4.5‰～28.3‰, 最适盐度为12.4‰, 稚贝(壳长约220 μm)的适盐范围与之相近[19-21]。本研究发现, 壳长2 cm的幼贝受高盐胁迫后, 行为会发生明显变化, 盐度45‰胁迫12 h时幼贝出现死亡, 且随着胁迫时间的延长, 死亡现象更加严重。尤其是S40和S45高盐度组, 168 h的死亡率分别达到96%和100%, 从死亡率上看出盐度超过35‰就会对幼贝机体造成较大损伤。目前, 计算半致死值的常用方法有寇氏法、直线内插法和概率单位法[22]。其中, 寇氏法简便有效、易于掌握, 但计算时应包含有死亡率为0和100%的组别, 所以有多个时间点不能满足寇氏法计算条件; 直线内插法和概率单位法因无太严格的条件限制, 应用简便而得到更广泛的应用。张广明等[16]运用概率单位法计算了魁蚶低盐胁迫的半致死盐度; 彭茂潇[25]使用直线内插法计算了不同规格缢蛏低盐的半致死盐度, 稚贝、幼贝、成贝的低盐48 h LC分别为1.45‰、1.29‰、0.75‰, 而本实验中运用概率单位法和直线内插法计算得到的缢蛏幼贝高盐72 h的LC分别为46.26‰和44.31‰, 证明缢蛏拥有强大的渗透压调节能力。同时, 概率单位法和直线内插法计算得到的其他胁迫时间的高盐LC结果相近, 说明研究结果较为可靠。

3.2　高盐对缢蛏幼贝NKA活性的影响

NKA是Na+/K+泵的重要活力成分, 对维持细胞中Na+、K+稳态发挥重要作用[26-27], 可以有效调节和维持机体渗透压[28], 是盐度适应相关研究的重点。水生生物中有关NKA的研究有很多, Shui等[29]的研究发现斑尾复虾虎鱼()在高盐胁迫时NKA活性先上升, 在12 h达到峰值后下降, 很多鱼类的研究结果与之类似; 甲壳类的相关研究中, 江山等[9]发现三疣梭子蟹在高盐胁迫时NKA活性先下降、后上升、再下降的趋势。本研究中, 缢蛏幼贝在高盐胁迫下NKA活性与成贝[30]相同。盐度由20‰转至30‰时, NKA活性呈现先上升后下降并逐步稳定的趋势; 盐度由20‰转至40‰时, NKA活性呈现先上升后下降再上升再下降的趋势。

当盐度发生骤变时, 缢蛏幼贝的NKA活性在短时间内发生大幅度波动, 推测是机体难以适应短时间内大幅度盐度变化的应激反应。高盐6 h后就出现NKA活性显著增加的情况, 可能使其适应了盐度由20‰转至30‰的变化, 但难以适应盐度20‰转至40‰的变化, 可能其自身难以维持长时间的NKA活性, 所以其NKA活性出现了波动的情况。值得注意的是, 96 h后, 高盐组NKA活性显著低于对照组, 幼贝对高盐的适应能力有限。结合幼贝在高盐下的存活情况, 盐度40‰应为缢蛏幼贝的耐受上限, 并且养殖池溏盐度最好低于30‰。

3.3　高盐对缢蛏幼贝ACP和AKP活性的影响

由于软体动物缺乏免疫球蛋白, 所以其体液免疫主要是依靠血清中的一些非特异性的酶或因子来进行的[31]。ACP和AKP是软体动物溶酶体酶的重要组成部分, 在免疫反应中发挥作用[32-33]。盐度胁迫造成贝类的血淋巴渗透压改变, 从而引起免疫系统的响应[27]。有研究表明盐度的变化会造成软体动物各项免疫指标的变化, 例如血清总蛋白、氧合血蓝蛋白含量、AKP、酚氧化酶(PO)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量, 从而降低生物体的免疫力[34]。本研究显示, 高盐胁迫后ACP和AKP的活性变化不一致, 盐度30‰胁迫的ACP活性没有显著性变化, 而盐度40‰组ACP活性在胁迫12 h时显著性上升后降低并趋于稳定。可能是在盐度30‰胁迫下, 其自身的调节并未影响内环境稳态, 所以其ACP活性没有显著性变化; 在盐度40‰胁迫下, 造成其内环境失衡, 在胁迫12 h后, NKA活性显著下降, ACP活性显著上升来维持。实验结果与郑萍萍等[11]对三疣梭子蟹的研究结果相似。高盐胁迫后AKP活性上升不显著, 这与时少坤等[12]报道的近江牡蛎高盐组的血淋巴AKP活力变化结果相似, 这可能是河口贝类应对高盐的反应特征。而Chen等[30]的报道中, 缢蛏成贝高盐胁迫(盐度35‰)肝胰腺组织AKP活力在胁迫12 h后有显著上升, 这可能与不同组织或种群差异有关。盐度30‰胁迫时, AKP活性显著下降后上升, 并恢复到之前的活性, 可能在渗透压调节过程中其自身免疫机制会受到影响。实验结果表明, 缢蛏适应盐度40‰难度较大, 但能适应盐度30‰, 并且24 h内应为其适应盐度30‰的关键时间点, 可能在适应过程中其他自身机制都会受到影响。本研究进一步丰富了缢蛏高盐胁迫相关的资料, 为缢蛏养殖及高盐新品系的培育提供了参考资料。

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Effects of high salt stress on survival and enzyme activities ofjuvenile

CAO Wei1, 2, CHI Chang-feng1, DONG Ying-hui4, BI Si-qi5, LIU Zhi-hong2, 3, SUN Xiu-jun2, 3, ZHOU Li-qing2, 3, WU Biao2, 3

(1. Zhejiang Ocean University, National Engineering Research Center of Marine Facilities Aquaculture, Zhoushan 316022, China; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qingdao 266071, China; 3. Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao 266071, China; 4. Zhejiang Wanli University, Key Laboratory of Aquatic Germplasm Resources of Zhejiang, Ningbo 315100, China; 5. Tianjin Agricultural College, Tianjin Key Laboratory of Aqua-ecology and Aquaculture College of Fisheries, Tianjin 300384, China)

To investigate the effects of high salt stress on the survival and enzyme activities ofjuvenile with a shell length of ～2 cm, the individuals were randomly divided into six groups with different salinities of 20‰ (S20), 25‰ (S25), 30‰ (S30), 35‰ (S35), 40‰ (S40) and 45‰ (S45). The mortalities ofjuvenile in each group were calculated, and the half lethal salinity (LC) at different stress times was analyzed by two methods. Furthermore, the activities of Na+-K+- ATPase (NKA), acid phosphatase (ACP), and alkaline phosphatase (AKP) of the individuals from groups S20, S30, and S40were analyzed, respectively. The results showed that the mortality rates of groups S20, S25, S30, S35, S40, and S45at 120 h were 0, (2.17±0.85)%, (9.50±0.82)%, (30.67±3.70)%, (73.50±7.08)%, and (94.67±3.06)%, respectively. All the individuals of group S45died at 168 h. TheLCof high salinity analyzed at 72, 96, 120, 144, and 168 h were 46.03‰、39.85‰、35.77‰、34.57‰ and 33.69‰, respectively, via the linear regression method, and 44.31‰, 40.74‰, 36.96‰, 35.67‰ and 34.47‰, respectively, via the probit analysis method. As the salinity increased and the treatment lasted longer, NKA, AKP, and ACP activities first increased, further decreasing and stabilizing. The three enzymes showed similar change trends with different effect times. Salinity above 30‰ might cause great damage to the body by reducing the osmotic pressure regulation and immune defense function. This study provides useful data for the future culture of.

juvenile; high salt stress;LC; enzyme activities

Jul. 25, 2021

[2025 Major Scientific and Technological Innovation Project of Ningbo, No. 2019B10005, No. 2021Z114; National Marine Genetic Resou­rce Center Project]

S917.4

A

1000-3096(2022)07-0044-08

10.11759/hykx20210725001

2021-07-25;

2021-12-29

宁波市科技创新2025重大专项(2019B10005, 2021Z114); 国家海洋水产种质资源库项目

曹伟(1996－), 男, 山东潍坊人, 硕士研究生, 研究方向: 贝类遗传育种, 电话: 17806275731, E-mail: 1824926985@qq.com; 吴彪,通信作者, 副研究员, 电话: 18953206830, E-mail: wubiao@ysfri.ac.cn

(本文编辑: 康亦兼)