18β-甘草次酸增强固有免疫细胞中I型干扰素响应进而协同抑制肝癌生长的机制研究

李 硕，白金钊，刘闰平

·药理与临床•

18β-甘草次酸增强固有免疫细胞中I型干扰素响应进而协同抑制肝癌生长的机制研究

李 硕，白金钊#，刘闰平*

北京中医药大学中药学院，北京 100029

在固有免疫细胞中明确18β-甘草次酸对I型干扰素通路的激动活性，并评价其在肝癌模型小鼠中的协同抑瘤作用。CCK-8法检测18β-甘草次酸对RAW264.7巨噬细胞增殖的影响；qRT-PCR法检测18β-甘草次酸对免疫细胞[RAW264.7细胞、小鼠骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages，BMDM）、小鼠骨髓来源树突状细胞（bone marrow-dendritic cells，BMDC）]中干扰素β1（interferon beta 1，）、干扰素刺激基因15（interferon stimulated gene 15，）和干扰素诱导蛋白1（interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1，）mRNA表达的影响；qRT-PCR法检测18β-甘草次酸与干扰素α2（interferon alpha 2，IFNα2）联用对免疫细胞中和mRNA表达的影响；Western blotting法检测18β-甘草次酸对IFNα2诱导的RAW264.7细胞Janus激酶1（Janus kinase 1，JAK1）、酪氨酸激酶2（tyrosine kinase 2，TYK2）、信号传导及转录激活因子1（signal transducers and activators of transcription 1，STAT1）和STAT2磷酸化水平的影响。C57BL/6小鼠通过原位移植瘤手术建立肝癌模型，随机分为模型组、奥沙利铂组和奥沙利铂＋18β-甘草次酸组，给予奥沙利铂和18β-甘草次酸治疗，评价小鼠体质量变化、肿瘤质量、脾质量、肝质量和肝脏系数。18β-甘草次酸显著升高了、和的mRNA表达水平（＜0.05、0.01、0.001），协同增强了IFNα2诱导的和的mRNA表达（＜0.05、0.01、0.001）；18β-甘草次酸促I型干扰素的活性可能依赖于其对IFNα2诱导的下游信号转导关键蛋白JAK1、TYK2、STAT1、STAT2磷酸化的增强作用（＜0.05、0.01、0.001）。18β-甘草次酸与奥沙利铂联用显著抑制了小鼠肝细胞癌原位移植瘤的恶性生长（＜0.01），并改善了奥沙利铂毒性相关的体质量下降。18β-甘草次酸能够激活JAK-STAT信号并诱导I型干扰素下游ISGs的表达，同时能与奥沙利铂协同抑制肝癌生长，从而发挥激活肿瘤免疫的作用。

18β-甘草次酸；I型干扰素；巨噬细胞；树突状细胞；肝癌；免疫调控

中医药的发展源远流长，历久弥新。中医药已在非典型性肺炎、新型冠状病毒肺炎、肺癌、乳腺癌、慢性炎症等免疫相关疾病的治疗中展现了其特色治疗优势[1-2]。中医对免疫的理解主要体现在“正气存内，邪不可干；邪之所凑，其气必虚”，所谓扶正，即为提高机体免疫能力[3]。现代研究显示，中药及其活性成分在免疫相关疾病的治疗中具有多层次、多靶点、稳定免疫系统、增强细胞免疫同时抑制炎症因子等特点[2]。如人参具有“大补元气”的功效，其活性成分人参皂苷Rg3通过下调细胞程序性死亡-配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）恢复T细胞对癌细胞的细胞毒性[4]；黄芪具有“补气升阳”之效，黄芪中的黄芪多糖是中国农业农村部批准使用的免疫增强剂，能够调节固有免疫和适应性免疫系统[5]；甘草具有“补脾益气、清热解毒”的功效，多篇研究报道了甘草及其活性成分能够通过调控核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路缓解溃疡性结肠炎、肝缺血再灌注损伤、急性肾损伤等疾病[6-8]。

固有免疫是宿主抵御病原微生物的第一道防线，也是人类炎症性疾病的重要调节剂[9]。I型干扰素（type I interferons，IFN-I）通过促进抗原呈递和自然杀伤细胞功能，同时抑制炎症信号和细胞因子的产生，在维持固有免疫稳态中发挥着重要作用。IFN-I家族由IFN-α、IFN-β、IFN-δ、IFN-ε、IFN-κ、IFN-τ和IFN-ω 7种成员构成[10]。IFN-I可以由大多数细胞感知病原体后分泌，以巨噬细胞和树突状细胞为代表的固有免疫细胞是其主要来源[11]。IFN-I以自分泌或旁分泌方式结合在由干扰素-α/β二聚体受体1（interferon alpha/beta receptor 1，IFNAR1）和IFNAR2亚基构成的异质二聚体跨膜受体上，随后激活Janus激酶1（Janus kinase 1，JAK1）和酪氨酸激酶2（tyrosine kinase 2，TYK2），并参与信号传导及转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）聚集、酪氨酸磷酸化和二聚物形成的过程。磷酸化的STAT1和STAT2形成二聚物并转移至核内，与干扰素调节因子9（interferon regulatory factors，IRF9）结合形成干扰素刺激基因因子3（interferon-stimulated gene factor 3，ISGF3），随后激活干扰素刺激基因（interferon-stimulated genes，ISGs）的转录[12]。ISGs可以通过正负向调控的方式平衡IFN-I介导的病原体识别与非特异性免疫应答，现已发现的ISGs分子有300多种，包括Isg15、干扰素诱导蛋白1（interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1，Ifit1）、寡腺苷酸合成酶（oligoadenylate synthase，OAS）等[13]。因其特殊活性，近年来以IFN-α、IFN-β为代表的IFN-I作为一种细胞因子在临床中被广泛研究和使用。多项研究表明，IFN-I在多种实体肿瘤与血液系统恶性肿瘤中能够抑制肿瘤生长，延长患者生存期。对其抗肿瘤活性机制的研究主要涉及激活免疫系统、抑制基因组甲基化、IFN-I通路靶点激活以及IFN-I产物ISGs作用等方面[14-16]。有研究者证明树突状细胞、巨噬细胞通过非特异性免疫系统环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）-干扰素基因刺激蛋白（stimulator of interferon gene，STING）途径产生IFN-I[17]，IFN-I能够直接或间接激活特定的免疫细胞，发挥强烈的T细胞反应，发挥对肿瘤的识别与消杀作用[18]。

本课题组前期研究发现，甘草水提物具有显著的IFN-I激活作用，并初步提示发挥该作用的单体成分可能是18β-甘草次酸。因此，本研究首先在体外系统探究了18β-甘草次酸对IFN-I活性的调控作用及其具体作用靶点，随后利用小鼠原位肝癌模型阐明其药理作用，为中药单体成分在IFN-I相关疾病的治疗提供实验证据和数据支撑。

1 材料

1.1 细胞

小鼠巨噬细胞RAW264.7和小鼠肝癌细胞Hep1-6购自美国ATCC。

1.2 动物

SPF级C57BL/6雄性小鼠，体质量20～25 g，8周龄，由斯贝福（北京）实验动物科技有限公司提供，许可证号SCXK（京）2019-0010。动物饲养于符合SPF标准的12 h光暗交替环境中，自由进食饮水。所有动物实验和研究经北京中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准号BUCM-4-2020083001-3011），并严格按照章程执行。

1.3 药品与试剂

18β-甘草次酸（批号471-53-4，质量分数≥98%）购自成都普思生物科技股份有限公司；鼠源重组蛋白IFNα2、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）、白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）购自苏州近岸蛋白质科技股份有限公司；DMEM培养基、RPMI 1640培养基、胎牛血清购自以色列BI公司；青霉素-链霉素（批号10378016）购自美国Invitrogen公司；橄榄油（批号8001-25-0）购自Baker Dream公司；奥沙利铂（oxaliplatin，OXA，批号61825-94-3）购自上海源叶生物科技有限公司；CCK-8检测试剂盒购自新赛美公司；BCA蛋白定量试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司；RNA提取试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；Western blotting高灵敏度化学发光检测试剂盒购自北京兰博利德生物技术有限公司；β-actin抗体（批号66009-1-lg）、t-JAK1抗体（批号66466-1-lg）、p-JAK1抗体（批号AP0530）、t-TYK2抗体（批号67411-1-lg）、p-TYK2抗体（批号AP0543）、t-STAT1抗体（批号A12075）、p-STAT1抗体（批号AP0453）、t-STAT2（批号A3588）、p-STAT2抗体（批号AP0284）购自美国Proteintech公司；HRP标记的山羊抗兔IgG抗体、HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体购自上海爱必信生物科技有限公司。

1.4 仪器

HERA cellvios 160i型CO2培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；CKX53型倒置光学显微镜（日本Olympus公司）；Spectramax i3x型酶标仪（美国Molecular Devices公司）；5424R型冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；Quant StudioTM6 Flex型qRT-PCR仪（美国ABI公司）；ChemiDocTM MP Imaging System（美国Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 细胞培养

RAW264.7细胞和Hep1-6细胞用含1%青霉素-链霉素、10%胎牛血清的DMEM培养基，于5% CO2、37 ℃培养箱中培养。根据细胞生长状态，2～3 d进行换液。当细胞密度达到80%～85%时，按1∶3进行传代培养。

2.2 小鼠骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages，BMDM）和小鼠骨髓来源树突状细胞（bone marrow-dendritic cells，BMDC）的提取与培养

选用8～10周龄雄性C57BL/6小鼠，脱颈处死后，剔除腿部肌肉及骨盆和股骨的剩余软组织，剪开腿骨两端，12 000×离心2 min，收集小鼠骨髓细胞。将收集的细胞培养于含10 %胎牛血清、10% L929细胞上清的RPMI 1640培养基中，第3、5天换液。培养7 d后，用刮板收集成熟的BMDM。

将小鼠骨髓细胞培养于含10%胎牛血清、20 ng/mL GM-CSF、10 ng/mL IL-4的RPMI 1640培养基中，第2、4天半量换液。第6天，收集悬浮及巯松贴壁生长的细胞，重新铺板后培养1～2 d，收集悬浮细胞即为成熟的BMDC。

2.3 CCK-8法检测RAW264.7细胞增殖

取处于对数生长期的RAW264.7细胞，以1×104个/mL接种于96孔板中，每孔100 μL，细胞贴壁后，分别加入不同浓度的含药培养基100 μL，使得18β-甘草次酸的最终浓度为1.25、5、20、40、60、80、120、160 μmol/L，每个浓度均设置3个复孔，对照组加入不含药物的培养基。培养24 h后，弃去培养基，每孔加入100 μL含10% CCK-8溶液的培养基，37 ℃避光孵育1 h，采用酶标仪测定450 nm处的吸光度（）值，计算细胞存活率。

细胞存活率＝(给药－对照)/对照

2.4 qRT-PCR检测RAW264.7细胞、BMDM、BMDC中Ifnb1、Isg15和Ifit1 mRNA表达

RAW264.7细胞、BMDM和BMDC分别以1×105个/孔接种于6孔板中，于37 ℃培养箱中孵育过夜后，更换新鲜培养基孵育1 h，加入不同浓度的药物，使得18β-甘草次酸的最终浓度为20、40、60 μmol/L；培养1 h后，相应的孔中加入IFNα2（50 ng/mL）。继续培养8 h后，按照试剂盒说明书提取细胞总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析。引物序列见表1，将次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1（hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1，）为内参。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因序列 (5’-3’) Hprt1F: CAGACTTTGTTGGATTTGAAA R: GCTCATCTTAGGCTTTGTAT Ifnb1F: CAGCTCCAAGAAAGGACGAAC R: GGCAGTGTAACTCTTCTGCAT Isg15F: GGTGTCCGTGACTAACTCCAT R: TGGAAAGGGTAAGACCGTCCT Ifit1F: CTGAGATGTCACTTCACATGGAA R: GTGCATCCCCAATGGGTTCT

2.5 Western blotting检测RAW264.7细胞中t-JAK1、p-JAK1、t-TYK2、p-TYK2、t-STAT1、p-STAT1、t-STAT2和p-STAT2蛋白表达

RAW264.7细胞以1×105个/孔接种于6孔板中，于37 ℃培养箱中孵育过夜后，更换新鲜培养基孵育1 h，加入50 ng/mL的IFNα2培养，分别于0.5、1、2、4、6 h弃去培养基，使用RIPA裂解缓冲液裂解细胞，提取总蛋白。

RAW264.7细胞以1×105个/孔接种于6孔板中，于37 ℃培养箱中孵育过夜后，更换新鲜培养基孵育1 h，加入不同浓度的药物使得18β-甘草次酸的最终浓度为20、40、60 μmol/L；培养1 h后，相应的孔中加入50 ng/mL的IFNα2。继续培养1 h后，弃去培养基，使用RIPA裂解缓冲液裂解细胞，提取总蛋白。

蛋白与Loading Buffer预混并加热变性，蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，于脱脂牛奶中封闭，分别加入相应抗体，4 ℃孵育过夜；TBST漂洗后，加入相应二抗孵育1 h。使用ChemiDocTM MP Imaging System软件进行成像，使用Quantity One软件进行图像分析。

2.6 动物分组、造模及给药

18只8周龄雄性C57BL/6小鼠通过手术建立肝癌模型。麻醉机麻醉小鼠并剃去腹部毛发，用酒精及碘伏棉球为剃毛部位消毒，沿剑突下方约0.5 cm处剪开长度约1.5 cm，用PBS润湿棉签将肝大叶挤出，使用微量注射器吸取50 μL Hep1-6细胞悬液（约4×106个），沿肝脏边缘注射。将肝大叶挤回原位后，逐层缝合伤口。再次对伤口消毒以防感染，将手术后小鼠放入干净鼠笼中，观察小鼠状态。

手术后随机分为模型组、奥沙利铂（7.5 mg/kg）组和奥沙利铂（7.5 mg/kg）＋18β-甘草次酸（100 mg/kg）组，每组6只。手术5 d后，奥沙利铂组和奥沙利铂＋18β-甘草次酸组ip奥利沙铂，模型组ip葡萄糖生理盐水，每2天1次，持续2周。奥沙利铂＋18β-甘草次酸组于第1次ip奥利沙铂后1 d开始，ig用含5%二甲基亚砜的橄榄油配制的18β-甘草次酸溶液，其他组ig含5%二甲基亚砜的橄榄油，每2天1次，持续2周（造模及给药流程见图1），并记录小鼠体质量变化。末次给药24 h后，小鼠麻醉处死，取肝脾脏，称定肿瘤、肝脏、脾脏质量，计算肝脏指数。

图1 造模及给药流程

2.7 统计学分析

实验数据采用GraphPad Prism 9.0软件进行分析，结果以表示，多组间比较采用One-way ANOVA分析。

3 结果

3.1 18β-甘草次酸对RAW264.7细胞增殖的影响

RAW264.7细胞是药物体外评价的常用细胞系。如图1所示，18β-甘草次酸浓度在75.33 μmol/L时RAW264.7细胞存活率下降至50%。因此，选择无明显细胞毒性的20、40和60 μmol/L分别作为低、中、高剂量进行后续研究。

图1 18β-甘草次酸对RAW264.7细胞增殖的影响

3.2 18β-甘草次酸促进IFN-I响应

首先在RAW264.7细胞中评价了单独给予高、中、低3个剂量的18β-甘草次酸对IFN-I响应的作用。如图2-A所示，在RAW264.7细胞中，与对照组相比，18β-甘草次酸中、高剂量组、和mRNA表达水平均显著升高（＜0.01、0.001），其中高剂量组更为明显，呈剂量相关性。巨噬细胞和树突状细胞均为IFN-I的主要来源，而RAW264.7细胞并无明显的分化倾向，无法针对性评价18β-甘草次酸调节IFN-I响应的主要靶细胞。因此，从小鼠腿骨中提取并培养原代BMDM与BMDC，考查18β-甘草次酸对2种免疫细胞中IFN-I的特异性作用。如图2-B所示，在BMDM中，18β-甘草次酸各剂量组和mRNA表达水平均显著升高（＜0.05、0.01、0.001），18β-甘草次酸低、中剂量组mRNA表达水平显著升高（＜0.05、0.01），其中低剂量组效果最佳，以上作用并没有显著的剂量相关性，可能与高剂量下BMDM对18β-甘草次酸耐受较差，存在一定细胞毒性相关。如图2-C所示，在BMDC中，18β-甘草次酸低、高剂量组mRNA表达水平显著升高（＜0.01、0.001），而和mRNA表达水平均无明显变化。表明与树突状细胞相比，18β-甘草次酸在巨噬细胞中具有更强的IFN-I激活作用。

C-对照组 18β-Ga-18β-甘草次酸，下同 与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

3.3 18β-甘草次酸促进IFNα2诱导的下游信号转导和ISGs表达

IFN-α是IFN-I的多效性细胞因子，目前已用于肝炎病毒、流感病毒等多种病毒感染性疾病及淋巴癌、黑色素瘤等多种癌症的临床治疗[19]。然而，治疗所需剂量大导致了明显的不良反应，严重限制了其在临床的广泛应用[20]。与低毒性、可以增敏IFN-I活性的天然产物的联用将有望降低IFN-α的使用剂量，从而提高其临床顺应性。因此，接下来探究了18β-甘草次酸与IFNα2合用对3种免疫细胞的影响。如图3-A所示，在RAW264.7细胞中，IFNα2增强了IFN-I诱导基因和的mRNA表达，与不同剂量的18β-甘草次酸合用后总体呈剂量相关性的增强：与对照组相比，高剂量的18β-甘草次酸与IFNα2合用后mRNA表达水平显著升高（＜0.001），中、高剂量的18β-甘草次酸与IFNα2合用后mRNA表达水平显著升高（＜0.01）。如图3-B所示，在BMDM中，IFNα2诱导了IFN-I下游和的mRNA表达水平（＜0.01、0.001）；当与不同剂量的18β-甘草次酸合用后，与对照组相比，mRNA表达水平均显著升高（＜0.05、0.01）；中、高剂量的18β-甘草次酸与IFNα2合用后mRNA表达水平显著升高（＜0.05、0.01）。如图3-C所示，在BMDC中，IFNα2显著增加了和的mRNA表达（＜0.01、0.001）；与对照组相比，各剂量的18β-甘草次酸与IFNα2合用后mRNA表达水平均显著升高（＜0.05、0.01）；低、中剂量的18β-甘草次酸与IFNα2合用后的mRNA表达水平显著升高（＜0.05、0.01）。18β-甘草次酸与IFNα2协同作用在BMDM和BMDC中均无显著的剂量相关性。上述结果表明，18β-甘草次酸与IFNα2合用能够增强其激活下游IFN-I诱导基因的作用。由于在RAW264.7细胞中18β-甘草次酸与IFNα2合用作用最强，且呈良好的剂量相关性，后续实验将选择RAW264.7细胞作为细胞模型探究其作用机制。

图3 18β-甘草次酸与IFNα2合用对RAW264.7细胞、BMDM和BMDC中Isg15和Ifit1 mRNA表达的影响

3.4 18β-甘草次酸促进JAK1、TYK2与STATs依赖的信号转导

为了确定18β-甘草次酸与IFNα2协同作用的具体分子靶点，首先探究了IFNα2在RAW264.7细胞中激活下游事件的最佳时间，分别考察了在给予IFNα2后0.5、1、2、4、6 h时，IFN-I下游信号转导关键蛋白JAK1、TYK2与STATs的磷酸化水平。如图4-A所示，t-JAK1在给予IFNα2后降低，而p-JAK1随时间持续增加。与对照组相比，JAK1磷酸化水平随作用时间而升高，在1 h时具有显著性差异（＜0.01），并在6 h达到最高点（＜0.001）。IFNα2对t-TYK2无明显影响，但显著升高了p-TYK2的水平，在1 h时作用最强（＜0.001）。t-STAT1、p-STAT1、t-STAT2、p-STAT2均在1 h时达到峰值，随后降低。IFNα2刺激细胞1 h后，与对照组相比，STAT1和STAT2的磷酸化水平均显著升高（＜0.001）。综合考虑上述结果，选择1 h作为IFNα2的诱导时间。

接下来考察了IFNα2联合不同剂量18β-甘草次酸对JAK1、TYK2与STATs磷酸化的影响。如图4-B所示，IFNα2刺激1 h后，IFNα2增加了JAK1、TYK2、STAT1、STAT2的磷酸化水平（＜0.05、0.001）。与IFNα2相比，低剂量的18β-甘草次酸降低了t-JAK1的水平，低、中剂量的18β-甘草次酸显著增强了JAK1磷酸化水平（＜0.05、0.001）。不同剂量的18β-甘草次酸均增加了t-TYK2水平，中、高剂量的18β-甘草次酸显著增强了TYK2的磷酸化水平（＜0.05、0.001）。低剂量18β-甘草次酸增加了t-STAT1、t-STAT2的水平，而中、高剂量18β-甘草次酸降低了t-STAT1、t-STAT2的水平，中、高剂量的18β-甘草次酸显著升高了STAT1和STAT2的磷酸化水平（＜0.01、0.001）。提示18β-甘草次酸增强了IFNα2诱导的JAK1、TYK2与STATs的激活，促进了IFN-I下游信号转导，是18β-甘草次酸协同增强IFN-I响应的内在机制。

A-IFNα2刺激RAW264.7细胞0.5～6 h，t-JAK1、p-JAK1、t-TYK2、p-TYK2、STATs和p-STATs蛋白表达；B-18β-甘草次酸与IFNα2合用后，t-JAK1、p-JAK1、TYK2、p-TYK2、STATs和p-STATs蛋白表达

3.5 18β-甘草次酸对小鼠肝细胞癌原位移植瘤生长的影响

如图5-A、B所示，与模型组相比，单用奥沙利铂改善了肝癌模型小鼠的体质量下降，减小了肿瘤体积；如图5-C所示，单用奥沙利铂组肿瘤质量降低为模型组的1/3（＜0.05），在一定程度上增加了脾脏质量，并降低了肝质量及肝脏指数（＜0.05）。18β-甘草次酸与奥沙利铂合用后进一步改善了小鼠的体质量下降；且肿瘤质量仅为奥沙利铂组的一半（＜0.01），肝质量及肝脏指数结果也明显优于奥沙利铂组（＜0.05、0.01）。此外，协同给药后脾质量有明显升高（＜0.05），提示18β-甘草次酸可能增强了机体的免疫反应。因此，18β-甘草次酸可能通过增强肿瘤免疫反应，协同奥沙利铂的抗肿瘤活性，抑制小鼠原位肝细胞癌的生长。

O-奥沙利铂组 与模型组比较：#P＜0.05；与奥沙利铂组比较：*P＜0.05 **P＜0.01

4 讨论

甘草是我国传统中药，有“国老”之称[21]，其主要活性成分18β-甘草次酸已被证明具有抗感染、消炎[22-23]、保肝[24]、抗肿瘤[25]等多种功效。目前对18β-甘草次酸的药理作用机制的研究主要集中于Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）/NF-κB、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、mTOR/STAT3等经典炎症通路[26]。IFN-I被认为是慢性炎症性疾病的枢纽，然而，目前18β-甘草次酸对IFN-I的作用尚不明确。本研究中，18β-甘草次酸单独使用或与IFNα2合用均能够增强固有免疫细胞中IFN-I诱导基因的表达，且在合用时作用更强。这一发现不仅确定了18β-甘草次酸是一种潜在的IFN-I天然激动剂，而且为18β-甘草次酸治疗免疫低下相关疾病的作用机制提供了新的思路。

当前研究认为，18β-甘草次酸通过加重细胞DNA损伤、激活p53促凋亡通路、增加活性氧的形成等途径诱导肝癌细胞凋亡[27-28]。已有研究证明，固有免疫系统识别肿瘤细胞并激活适应性免疫系统发挥消杀作用依赖于IFN-I信号的激活[29]。鉴于体外实验中18β-甘草次酸对IFN-I的免疫调节作用及IFN-I的肿瘤免疫调节作用，推测增强IFN-I响应、逆转免疫抑制性肿瘤微环境可能是其抗肿瘤的新机制。因此，基于18β-甘草次酸在IFN-I介导的免疫应答中的作用，构建小鼠肝癌模型来评价其潜在肿瘤免疫药理作用。化学诱导肝癌模型和移植肝癌模型是目前最为常用的小鼠肝癌模型，然而，化学诱导法的诱癌时间较长，一般为24～48周[30]；人源肿瘤异种移植操作较为复杂且成本高，且因为缺乏完整的免疫功能而不适用于肿瘤免疫疗法研究[31]。因此，本研究通过将鼠源肝癌细胞系Hep1-6细胞的细胞悬液直接注射到小鼠肝大叶建立同种原位移植瘤模型，该模型具有成本相对较低、成活率高、成瘤速度快、具有完整的免疫微环境和肝微循环环境等优点。通过与一线化疗药物奥沙利铂合用，18β-甘草次酸显著抑制了原位肝癌的恶性生长，并改善了奥沙利铂毒性相关的体质量下降。一方面，18β-甘草次酸与奥沙利铂联用后可能通过增强IFN-I介导的抗肿瘤免疫提高化疗药物对癌细胞的化学敏感性；另一方面，奥沙利铂是一类免疫治疗药物，通过诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡，在细胞表面产生一种“吃我”的信号分子，使得肿瘤细胞更容易被固有免疫细胞识别并吞噬[32-33]，18β-甘草次酸增强IFN-I介导的固有免疫的作用有助于奥沙利铂诱导抗肿瘤免疫应答。尽管奥沙利铂已广泛用于直肠癌、肺癌、肝癌等恶性肿瘤的治疗，但是还存在一些不良反应，单独给药存在着患者响应率低、可能引起细胞因子风暴等隐患，与其他小分子化疗药的联用也产生了患者依从性差、失败率高等问题[29]。本研究提示，与18β-甘草次酸的联合用药有望改善奥沙利铂的不良反应，还为IFN-I的天然小分子激动剂与化疗药物联用在抗肿瘤中的作用机制提供了新的思路。

综上所述，本研究证明了18β-甘草次酸能够显著激活JAK-STAT信号并诱导IFN-I下游ISGs的表达，同时阐明了18β-甘草次酸与奥沙利铂协同激活肿瘤免疫从而抑制肝癌生长的作用。这些发现不仅为全面理解18β-甘草次酸的免疫调节作用提供了新的见解，并且为18β-甘草次酸与具有肿瘤细胞免疫原性的化疗药物联用的抗肿瘤新策略研究提供了实验证据和新的思路。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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18β-Glycyrrhetinic acid enhances response of type I interferon in innate immune cells and inhibits hepatocellular carcinoma growth

LI Shuo, BAI Jin-zhao, LIU Run-ping

School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China

To identify the regulative effects of 18β-glycyrrhetinic acid (18β-Ga) on type I interferon (IFN-I) responses in innate immune cells, and evaluate its antitumor effects in hepatocellular carcinoma (HCC) model mice.CCK-8 assay was performed to detect the effect of 18β-Ga on proliferation of RAW264.7 cells. qRT-PCR was used to detect the effect of 18β-glycyrrhetinic acid on interferon beta 1 (), interferon stimulated gene 15 () and interferon-induced protein 1 () mRNA expressions in immune cells [RAW264.7 cells, mouse bone marrow-derived macrophages (BMDM), mouse bone marrow-derived dendritic cells (BMDC)]. qRT-PCR analysis was used to detect the mRNA levels ofandupon 18β-Ga and IFNα2 administration in immune cells. The phosphorylation levels of Janus kinase 1 (JAK1), tyrosine kinase 2 (TYK2), signal transducers and activators of transcription 1 (STAT1) and STAT2 were detected by western blotting. Hepatocellular carcinoma model was established by orthotopic tumor transplantation, and model mice were randomly divided into model group, oxaliplatin group, oxaliplatin + 18β-Ga group. Mice were treated with oxaliplatin and 18β-Ga after modeling. Body weight, tumor weight, spleen weight, liver weight and liver coefficient were evaluated.18β-Ga significantly increased the mRNA levels of,andexpression (< 0.05, 0.01, 0.001) and facilidated IFNα2-inducedandexpressions (< 0.05, 0.01, 0.001). IFN-I-promoting activity of 18β-Ga may depend on the enhancement of JAK1, TYK, STAT1, and STAT2 phosphorylation (< 0.05, 0.01, 0.001). The combination of 18β-Ga and oxaliplatin significantly inhibited the tumor growth of hepatocellular carcinoma orthotopic xenograft tumors in mice (< 0.01), and improved the weight loss associated with oxaliplatin toxicity.18β-Ga has significant stimulatory effects on immune response by enhancing JAK-STAT signaling and inducing the ISGs expression in response to IFN-I. Meanwhile, 18β-Ga can synergistically inhibit the growth of liver cancer with oxaliplatin, thereby activating tumor immunity.

18β-glycyrrhetinic acid; type I interferon; macrophage; dendritic cell; hepatocellular carcinoma; immunoregulation

R285.5

A

0253 - 2670(2022)16 - 5034 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.16.013

2022-05-25

国家自然科学基金资助项目（82004029）；北京市科技新星项目（Z201100006820025，Z211100002121167）；中华中医药学会青年人才托举工程（CACM-2020-QNRC2-04）

李 硕，硕士研究生，研究方向为天然产物的免疫活性。E-mail: ls18845611672@163.com

刘闰平，教授，博士生导师，研究方向为消化系统疾病机制和潜在治疗靶点的转化医学研究。E-mail: liurunping@bucm.edu.cn

#共同第一作者：白金钊，硕士研究生，研究方向为中药消化药理。E-mail:baijz@foxmail.com

[责任编辑 李亚楠]