MEBT／MEBO 对大鼠糖尿病溃疡创面组织中血管新生的影响研究

魏德华 王 成 陈世玖 刘珑玲 刘 宇

糖尿病溃疡是长期高糖环境刺激机体正常组织所致的局部细胞结构受损及功能改变， 常伴有周围神经血管病变和感染［1］。 近年来随着对糖尿病溃疡认识的不断深入， 部分学者发现新生血管形成过程中断可导致创面血供不足， 严重影响肉芽组织形成及上皮组织再生， 进而延迟糖尿病溃疡创面的愈合［2－4］， 而血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF） 作为目前已知促进血管生成的最有效且直接的血管生成因子， 具有诱导内皮细胞增殖、 促进血管重构及血管新生等作用， 在血管新生过程中必不可少［5］； CD34 作为重要的血管内皮细胞标志物， 在血管内皮细胞中呈高表达状态，可反映创面血管新生情况［6－7］。 诸多临床研究表明［8－9］， 创疡再生医疗技术 （moist exposed burn treatment／moist exposed burn ointment， MEBT／MEBO）可促进糖尿病溃疡创面组织中微血管的形成、 成纤维细胞的增殖与毛细血管的再生［10－11］， 在糖尿病溃疡创面的治疗中取得了较好的临床疗效。 但从VEGF 与CD34 角度分析MEBT／MEBO 作用机制的研究鲜见报道。 鉴于此， 本研究笔者对其进行研究分析， 以期为MEBT／MEBO 的临床应用提供理论依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

8 ～12 周龄SPF 级雄性SD 大鼠60 只， 体质量220 ～250 g， 均购自济南朋悦实验动物繁育有限公司， 并饲养于遵义医科大学珠海校区清洁级动物实验室， 室温控制在20 ～25 ℃， 相对湿度控制在60%， 单笼饲养， 自由饮水、 进食。 本研究经遵义医科大学珠海校区实验动物伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与设备

湿 润 烧 伤 膏 （moist exposed burn ointment，MEBO）： 汕头市美宝制药有限公司生产， 国药准字Z20000004； 链脲佐菌素（streptozotocin， STZ）：北京索莱宝科技有限公司生产； 一次性使用负压引流护创材料： 苏州爱得科技发展有限公司生产， 苏食药监械 （准） 字2011 第2661009 号； 希迪克HB⁃V⁃B⁃100 便携式负压引流器： 河南汇博医疗股份有限公司生产， 豫械注准20172540896； 异氟烷：深圳市瑞沃德生命科技有限公司生产； 免疫组化试剂盒： 江苏凯基生物技术股份有限公司生产；Rabbit⁃anti⁃CD34： 北京博奥森生物技术有限公司生产； VEGF、 β⁃actin 引物序列： 生工生物工程（上海） 股份有限公司生产； One Step TB GreenTMPrimeScriptTMRT⁃PCR Kit Ⅱ（SYBR Green）： 日本TaKaRa 公司生产。

2 方法

2.1 模型制备与分组

60 只大鼠适应性饲养1 周后， 禁食12 h， 采用随机数表法将其随机分为模型对照组、 MEBO 组和VSD 组， 每组20 只。 所有大鼠均于腹腔注射1% STZ （40 mg／kg） 建立糖尿病模型， 待出现多饮、 多食、 多尿、 体重明显减轻等症状且随机血糖≥16.7 mmol／L 即视为糖尿病大鼠模型制备成功； 继而， 3%异氟烷吸入麻醉， 背部备皮、 消毒后， 于背部相同位置做直径2.0 cm 深达筋膜层的全层皮肤缺损创面。

2.2 创面处理

模型对照组大鼠创面采用凡士林油纱换药处理， 常规碘伏消毒、 无菌纱布拭净后， 依次覆盖凡士林油纱及无菌干纱布包扎固定， 每天换药1 次；MEBO 组大鼠创面采用MEBO 换药处理， 常规碘伏消毒、 无菌纱布拭净后， 均匀涂抹MEBO， 并依次覆盖MEBO 药纱及无菌干纱布包扎固定， 每天换药1 次； VSD 组大鼠创面采用负压封闭引流（vacuum sealing drainage， VSD） 处理， 常规碘伏消毒、 无菌纱布拭净后， 放置聚氨脂吸水纤维敷料（放置面积大于创面边缘0.5 cm） 并固定， 叠瓦式粘贴半透膜， 连接便携式负压引流器持续负压引流， 压力控制在－100 ～－80 KPa， 每3 d 更换1 次聚氨脂吸水纤维敷料。

2.3 标本采集与处理

分别于干预第7、 14 天， 每组随机选取6 只大鼠， 于异氟烷麻醉后在超出创缘0.3 cm 处完整切除整块创面肉芽组织， 并将其均分为2 份后， 一份置于冻存管中， 放入液氮罐保存备用； 一份用滤纸包裹置于包埋盒中， 放入4 ℃冰箱保存备用。

2.4 创面愈合率

分别于干预第3、 7、 10、 14 天， 随机选取6只大鼠将标尺置于创面边缘后对创面进行拍照， 使用Image J 软件测定创面面积， 计算创面愈合率。创面愈合率＝ （创面初始面积－ 时相点创面面积） ／创面初始面积×100%。

2.5 CD34 免疫组化染色检测创面组织微血管密度（microvascular density， MVD）

取4 ℃冰箱中保存备用的组织， 常规予以脱水、 石蜡包埋、 切片、 脱蜡后进行CD34 免疫组化染色， 于50 倍光学显微镜下选取血管密度最高的3个区域， 继而在200 倍光学显微镜下选择5 个不重叠区域， 计算微血管数量， 取其平均值。

2.6 RT⁃PCR 技术检测创面组织中VEGF mRNA 表达水平

取出液氮中冻存的创面组织， 采用Trizol 法将组织充分研磨、 裂解、 离心后提取总RNA， 全自动核酸分析仪测定样品在260 nm 和280 nm 的光密度 （optical density， OD） 值 以 及 RNA 浓 度，OD260／280 为1.8 ～2.1 视为提取成功； 在10 μl 反转录体系中反转录合成cDNA 进行PCR 扩增， 扩增条件为95 ℃5 min， 95 ℃15 s， 60 ℃20 s， 72 ℃40 s， 共40 个 循 环； 以 甘 油 醛⁃3⁃磷 酸 脱 氢 酶（glyceraldehyde⁃3⁃phosphate dehydrogenase， GAPDH）作为内参基因， 测得Ct 值， 使用2－△△Ct法计算mRNA 相对表达量。 引物序列： VEGF 上游5’ ⁃AACCTCACCAAAGCCAGCACAT⁃3 ’， 下 游 5 ’ ⁃CCGCTCTGAACAAGGCTCACA⁃3’； GAPDH 上 游5’ ⁃AGGTTGTCTCCTGTGACTTCAA⁃3’， 下游5’ ⁃CTGTTGCTGTAGCCATATTCATTG⁃3’。

2.7 统计学处理

采用SPSS 23.0 统计软件对所得数据进行统计学分析， 符合正态分布的数据以均数± 标准差（±s） 表示， 多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用q检验， 均以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 3 组大鼠糖尿病溃疡创面愈合率对比

干预第3、 7、 10、 14 天， 模型对照组大鼠创面愈合率均明显低于MEBO 组与VSD 组（P均＜0.05）； 干预第14 天， MEBO 组大鼠创面愈合率明显高于VSD 组（P＜0.05）， 其余各时间点MEBO 组与VSD 组间无明显差异（P均＞0.05）， 详见表1、 图1。

图1 不同时间点3 组大鼠糖尿病溃疡创面愈合情况对比图Fig.1 Comparison of the healing condition of diabetic wounds in rats among the three groups at different time points

表1 不同时间点3 组大鼠糖尿病溃疡创面愈合率对比（%， ±s）Table 1 Comparison of healing rates of diabetic wounds in rats among the three groups at different time points （%， ±s）

表1 不同时间点3 组大鼠糖尿病溃疡创面愈合率对比（%， ±s）Table 1 Comparison of healing rates of diabetic wounds in rats among the three groups at different time points （%， ±s）

注： MEBO 为湿润烧伤膏， VSD 为负压封闭引流； 模型对照组大鼠创面采用凡士林油纱换药处理， MEBO 组大鼠创面采用MEBO换药处理， VSD 组大鼠创面采用VSD 处理。 与模型对照组对比，aP ＜0.05， 差异具有统计学意义； 与MEBO 组对比， bP ＜0.05， 差异具有统计学意义Note： MEBO－moist exposed burn ointment， VSD－vacuum sealing drainage； The wounds in control group were treated with dressing change of Vaseline gauze， wounds in MEBO group were treated with dressing change of MEBO， and wounds in VSD group were treated with VSD. Sta⁃tistically significant differences were observed as compared with control group （aP ＜0.05） and with MEBO group （bP ＜0.05）

组别Group只数Number of rats第3 天Day 3第7 天Day 7第10 天Day 10第14 天Day 14模型对照组Control group 6 11.6 ±2.5 33.8 ±2.3 56.4 ±1.9 79.9 ±1.5 MEBO 组MEBO group 6 17.5 ±1.8a 51.2 ±1.1a 73.0 ±1.9a 92.8 ±1.4a VSD 组VSD group 6 15.8 ±1.8a 49.0 ±1.5a 70.4 ±1.8a 89.7 ±1.9ab F 值F value 13.042 184.677 137.185 104.371 P 值P value ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3.2 3 组大鼠糖尿病溃疡创面组织中MVD 对比

干预第7、 14 天， 模型对照组大鼠创面组织中MVD 均明显低于MEBO 组与VSD 组 （P均＜0.05）， 且VSD 组大鼠创面组织中MVD 又明显低于MEBO 组（P均＜0.05）， 详见表2。 干预第7天， 模型对照组大鼠创面组织中可见极少量散在分布的棕黄色颗粒， 而MEBO 组和VSD 组大鼠创面组织中均可见较多密集分布的棕黄色颗粒； 干预第14 天， 模型对照组、 MEBO 组、 VSD 组大鼠创面组织中均可见大量密集分布的棕黄色颗粒， 且MEBO组和VSD 组棕黄色颗粒量明显多于模型对照组， 详见图2。

图2 不同时间点3 组大鼠糖尿病溃疡创面组织CD34 免疫组化染色图（ ×400）Fig.2 Immunohistochemical staining of CD34 in diabetic wound tissues of rats among the three groups at different time points （ ×400）

表2 不同时间点3 组大鼠糖尿病溃疡创面组织中MVD 对比（条／mm2， ±s）Table 2 Comparison of MVD in diabetic wound tissues of rats among the three groups at different time points （microvessel／mm2， ±s）

表2 不同时间点3 组大鼠糖尿病溃疡创面组织中MVD 对比（条／mm2， ±s）Table 2 Comparison of MVD in diabetic wound tissues of rats among the three groups at different time points （microvessel／mm2， ±s）

注： MEBO 为湿润烧伤膏， VSD 为负压封闭引流， MVD 为微血管密度； 模型对照组大鼠创面采用凡士林油纱换药处理， MEBO组大鼠创面采用MEBO 换药处理， VSD 组大鼠创面采用VSD 处理。与模型对照组对比， aP ＜0.05， 差异具有统计学意义； 与MEBO 组对比， bP ＜0.05， 差异具有统计学意义Note： MEBO－moist exposed burn ointment， VSD－vacuum sealing drainage， MVD－microvascular density； The wounds in control group were treated with dressing change of Vaseline gauze， wounds in MEBO group were treated with dressing change of MEBO， and wounds in VSD group were treated with VSD. Statistically significant differences were observed as compared with control group （ aP ＜0.05） and with MEBO group （bP ＜0.05）

组别Group只数Number of rats第7 天Day 7第14 天Day 14模型对照组Control group 6 33.81 ±1.49 45.65 ±5.98 MEBO 组MEBO group 6 59.58 ±2.64a 76.33 ±4.70a VSD 组VSD group 6 49.22 ±5.42ab 64.19 ±3.08ab F 值F value 78.480 63.815 P 值P value ＜0.001 ＜0.001

3.3 3 组大鼠糖尿病溃疡创面组织中VEGF mRNA表达水平对比

干预第7、 14 天， 模型对照组大鼠创面组织中VEGF mRNA 表达水平均明显低于MEBO 组与VSD组（P均＜0.05）， VSD 组大鼠创面组织中VEGF mRNA 表达水平又明显低于MEBO 组 （P均＜0.05）， 详见表3。

表3 不同时间点3 组大鼠糖尿病溃疡创面组织中VEGF mRNA 表达水平对比（ ±s）Table 3 Comparison of expression levels of VEGF mRNA in wound tissues of rats among the three groups at different time points （ ±s）

表3 不同时间点3 组大鼠糖尿病溃疡创面组织中VEGF mRNA 表达水平对比（ ±s）Table 3 Comparison of expression levels of VEGF mRNA in wound tissues of rats among the three groups at different time points （ ±s）

注： MEBO 为湿润烧伤膏， VSD 为负压封闭引流， VEGF 为血管内皮生长因子； 模型对照组大鼠创面采用凡士林油纱换药处理，MEBO 组大鼠创面采用MEBO 换药处理， VSD 组大鼠创面采用VSD处理。 与模型对照组对比， aP ＜0.05， 差异具有统计学意义； 与MEBO 组对比， bP ＜0.05， 差异具有统计学意义Note： MEBO－moist exposed burn ointment， VSD－vacuum sealing drainage， VEGF－vascular endothelial growth factor； The wounds in con⁃trol group were treated with dressing change of Vaseline gauze， wounds in MEBO group were treated with dressing change of MEBO， and wounds in VSD group were treated with VSD. Statistically significant differences were observed as compared with control group （ aP ＜0.05） and with MEBO group （bP ＜0.05）

组别Group只数Number of rats第7 天Day 7第14 天Day 14模型对照组Control group 6 1.10 ±0.08 1.06 ±0.20 MEBO 组MEBO group 6 2.13 ±0.29a 3.30 ±0.57a VSD 组VSD group 6 1.49 ±0.23ab 2.04 ±0.29ab F 值F value 33.946 50.550 P 值P value ＜0.001 ＜0.001

4 讨论

血管新生是创面愈合过程中的重要环节， 贯穿创面愈合全程［12］， 继发性外周血管破坏和血管再生困难是导致糖尿病溃疡创面难以愈合的关键［13－14］。 相关研究显示， VEGF 可通过促使血管内皮通透性增加、 细胞外基质成分改变诱导新生血管的形成［15］。 MEBT／MEBO 的核心药物MEBO 通过有效液化排除创面坏死组织、 激活创面潜能再生细胞、 促进肉芽组织中新生血管形成等作用在糖尿病溃疡等创面愈合中取得了较好的临床疗效［16－18］。本研究笔者为进一步探究MEBO 在糖尿病溃疡创面新生血管形成方面的作用机制， 观察了MEBO 对大鼠糖尿病溃疡创面愈合率及创面组织中MVD 与VEGF mRNA 表达水平的影响。

VEGF 是一种高度特异性的血管内皮生长因子，通过自分泌、 旁分泌、 胞内分泌等方式作用于血管内皮细胞受体， 促进血管内皮细胞生长、 细胞外基质降解、 血管管型结构形成； 还可通过提高血浆酶原活化因子的活性， 促使细胞外蛋白水解， 进而促进新生毛细血管形成［19－20］。 CD34 是高度糖基化的Ⅰ型跨膜糖蛋白， 参与造血干细胞的运输、 定植，其免疫组化检测可作为血管生成的标志。 吕国忠等［21］的研究发现， VSD 可通过调控表皮生长因子受体、 VEGF 等因子的表达， 加速血管内皮细胞增殖、 分化以及创面血管网重建， 促进糖尿病溃疡创面愈合。 刘明等［18］的研究显示， MEBT／MEBO 可通过提高糖尿病溃疡创面组织中VEGF 的表达， 促进创面血管新生及成熟， 提高糖尿病溃疡创面的愈合能力。 本研究结果显示， 干预第3、 7、 10、 14天， 模型对照组大鼠创面愈合率均明显低于MEBO组与VSD 组， 且干预第14 天VSD 组大鼠创面愈合率又明显低于MEBO 组； 干预第7、 14 天， 模型对照组大鼠创面组织中MVD 及VEGF mRNA 表达水平均明显低于MEBO 组与VSD 组， 且VSD 组又明显低于MEBO 组； 干预第14 天， 模型对照组、MEBO 组、 VSD 组大鼠创面组织中均可见大量密集分布的棕黄色颗粒， 且MEBO 组与VSD 组棕黄色颗粒量明显多于模型对照组。 可见， MEBT／MEBO和VSD 均能明显增加糖尿病溃疡创面组织中VEGF mRNA 的表达水平， 促进糖尿病溃疡创面组织中微血管的生成， 进而促进创面愈合， 且MEBT／MEBO的效果更加明显。 其原因可能与MEBT／MEBO 在糖尿病溃疡创面愈合后期的促血管生成能力较VSD更强［22－23］有关。

综上所述， MEBT／MEBO 可通过提高VEGF mRNA 的表达水平促进血管生成， 进而促进糖尿病溃疡创面愈合， 效果明显优于凡士林油纱与VSD。但本研究样本量较小， 结果可能存在偏倚， 且研究时间较短， 糖尿病溃疡创面未能全部愈合， 还需扩大样本量进行验证。