杜仲叶提取物对育肥猪肉品质和抗氧化性能的影响

杨玉环，梁晓晓，殷运菊，龚赛明，郭秋平，段叶辉，张灵煜,4，王文龙，李凤娜*

（1.动物营养生理与代谢过程湖南省重点实验室，中国科学院亚热带农业生态研究所亚热带农业生态过程重点实验室，农业部中南动物营养与饲料科学观测实验站，畜禽养殖污染控制与资源化技术国家工程实验室，湖南长沙 410125；2.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙 410128；3.河南农业大学动物科技学院，河南郑州 450046；4.中国科学院大学现代农业科学学院，北京 100049）

我国是猪肉生产和消费大国，随着集约化养殖场的建立，猪肉产量大幅提高，人们已更加重视猪肉品质和安全。生产优质猪肉成为养殖行业追求的目标，而营养调控是一种有效可行的手段。植物提取物绿色健康且资源丰富，作为饲料添加剂有诸多调控效果，并对提高猪肉品质有一定作用，杜仲叶提取物便是其中之一。

杜仲（，EU）又名丝连皮、扯丝皮、丝棉皮、玉丝皮、思仲、思仙、胶树等，为杜仲科杜仲属多年生落叶乔木，是我国独有药材，也是世界宝贵的药源植物资源。杜仲在我国主要分布于四川、贵州、湖北、湖南、陕西、甘肃、河南、安徽、江西等地。《中国药典》中记载，杜仲一般4～6 个月剥取，堆置“发汗”至内皮紫褐色，晒干，生用或盐水炙用，其药性甘、温，归肝经、肾经。杜仲富含木脂素类、环烯醚萜类、黄酮类及多糖类等多种活性成分，具有降压、调节血脂、降血糖、抗炎、肝保护、抗肿瘤等药理作用，广泛应用于中医临床复方及多种中成药中。杜仲作为中草药饲料添加剂在动物饲养领域的科学探究也逐渐深入。本试验旨在研究不同水平的杜仲叶提取物全程饲喂对猪肉品质和抗氧化性能的影响，以期为高品质猪肉的生产实践及杜仲叶提取物更广泛的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 杜仲叶提取物购买自张家界恒兴生物科技有限公司，有效成分包括5%绿原酸、8%杜仲黄酮、20% 杜仲多糖等（数据由公司提供）。总抗氧化能力（T-AOC）检测试剂盒为南京建成生物工程研究所产品，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）检测试剂盒为长沙奥基生物科技有限公司产品。

1.2 试验设计 选用144 头（10.11±0.03）kg、体况良好的杜×长×大三元杂交断奶仔猪，采用单因子试验设计，按体重相近原则随机分为4 组，每组6 个重复，每个重复6 头猪。对照组饲喂基础日粮，试验组分别在基础日粮中添加0.1%、0.2%、0.3%杜仲叶提取物。

1.3 基础日粮及饲养管理 试验采用玉米-豆粕型饲粮，参考NRC（1998，2012）设计基础日粮（对照组），基础日粮组成及营养成分如表1 所示。试验全程自由采食和饮水。每天打扫猪舍卫生，每周进行1 次喷雾消毒，试验猪定期打疫苗及除虫，每天观察并记录猪只的健康状况和采食情况，以重复为单位记录猪喂料量、余料量和损耗料量。

表1 基础日粮组成及营养成分

1.4 屠宰与样品采集 屠宰前12 h 禁食且自由饮水。每组挑选8 头体重接近的健康试验猪（共32 头）进行屠宰采样。颈静脉采血至专用采血管中，室温静置1 h 后在3 000 r/min 和4℃条件下离心10 min，吸取上清于EP 管中-80℃保存待测。猪屠宰后，取背最长肌（6～7肋骨处）和股二头肌，二者均分成4 份，分别用于pH和肉色、常规养分、酶活和24 h 后的肉品质检测分析。用于常规养分和酶活检测的样品置于干冰上转移至-20℃冰箱保存待测，用于肉品质检测的样品置于冰上转移至4℃保存待测；另采集肝脏样品，液氮速冻后转移至-80℃冰箱保存待测。

1.5 指标测定与方法

1.5.1 生长性能 分别在试验开始和结束时称重，每天记录猪的采食量和饲料损耗量，计算得出平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和耗料增重比（F/G）。

1.5.2 肉品质 按照《猪肉品质测定技术规程》（NY/T 821-2019）检测试验猪屠宰后45 min 和24 h 背最长肌以及股二头肌的pH、肉色、滴水损失和系水力，使用的设备包括手持式pH 计（pH-STAR，MATTHAUS，德国）、色差仪（CR-410，Minolta，日本）、压肉仪（Bulader-M10，Bulader，北京）。按照《肉嫩度的测定 剪切力法》（NY/T 1180-2006）检测背最长肌和股二头肌的嫩度，所用仪器为质构仪（TMS-pro，FTC，英国）。

1.5.3 肌肉化学组成 用凯氏定氮法检测猪背最长肌和股二头肌中的粗蛋白质（CP）含量。按照《食品中脂肪的测定》（GB/T 5009.6-2016）用索式抽提法检测背最长肌和股二头肌中肌内脂肪（IMF）含量，所用仪器为全自动索式抽提仪（SOX416，Soxtherm，德国）。按照《猪肉品质测定技术规程》（NY/T 821-2019）用高效液相色谱法检测背最长肌和股二头肌中的肌苷酸（IMP）含量，所用仪器为高效液相色谱仪（Agilent1290，Agilent，美国）。

1.5.4 游离氨基酸 股二头肌中的游离氨基酸含量采用气-质联用仪（GC-MS，Trace 2000 DSQ，Thermo Finnigan 公司）检测。用超纯水（Milli-Q，Millipore）配制各种氨基酸标准曲线。GC-MS 条件：DB-5 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent Techonologies）；载气为高纯氦气，柱流速 1 mL/min，进样口温度230℃，注射温度 270℃，分流比 30～50:1（取决于不同的氨基酸浓度），柱温程序：起始温度 120℃，保持2 min，以5℃/min 速度升温至 270℃，保持 10 min；进样体积 1 μL，质谱离子扫描范围为 200～510 m/z。数据用Empower3 软件（沃特世科技有限公司，上海）采集和处理。

1.5.5 血清和肝脏抗氧化性能检测 取肝脏分子样，加液氮在研钵里充分研磨，放入装有研磨珠的EP 管中，加入适量DEPC 水及蛋白酶抑制剂，用匀浆机充分混匀离心取上清制成组织匀浆液。匀浆液和血清按试剂盒说明书要求检测T-AOC、GSH-Px、SOD 和CAT 活性以及MDA 浓度。

1.5.6 肝脏抗氧化相关基因mRNA 表达检测 取肝脏分子样，加液氮在研钵中充分研磨，迅速转入加有1 mL TRIzol 的1.5 mL 无菌无酶EP 管中，在超净工作台内进行总RNA 的提取，提取完成测RNA 的浓度和纯度，OD/OD在1.8～2.2 为合格样品，将所有样品RNA浓度调整到1 000 ng/μL 再用的Evo M-MLV 反转录试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）反转录成cDNA。使用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR 试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）进行实时荧光定量PCR 检测。PCR 体系由5 μL SYBR Green Pro Taq HS Premix、2 μL cDNA、2.2 μL 无RNA 酶的水和0.4 μL 引物对组成，总体积为10 μL。荧光定量PCR 仪程序包括95℃30 s 1 个循环，95℃5 s 40 个循环，60℃30 s。检测SOD、谷胱甘肽过氧化物酶（）和核因子E2相关因子2（）的基因表达量。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（）为内参基因，按照2（ΔΔCt=ΔCt-ΔC）的计算方法计算各基因mRNA 的相对表达量。引物序列如表2 所示。

表2 RT-qPCR 引物序列

1.6 统计分析 数据用Excel 2019 初步整理，用SPPS 26.0 软件进行单因素方差分析和Duncan's 多重比较，并采用正交多项式对比法评价饲粮中添加杜仲叶提取物对试验动物检测指标的线性和二次效应。结果用平均值和标准误来表示。<0.05 表示差异显著，0.05<<0.1表示有统计学意义。

2 结果

2.1 杜仲叶提取物对育肥猪生长性能的影响 由表3可知，0.1%杜仲叶提取物组ADFI 高于0.3%杜仲叶提取物组（<0.05），但与另外两组无显著性差异。日粮添加杜仲叶提取物对生长育肥猪ADG 和F/G 均无显著影响。

表3 日粮添加不同水平杜仲叶提取物对育肥猪生长性能的影响（n=6）

2.2 杜仲叶提取物对育肥猪背最长肌和股二头肌肉品质的影响 由表4 可知，与对照组相比，杜仲叶提取物水平从0%增加到0.2%，背最长肌pH呈线性上升（<0.05），pH呈二次曲线上升（<0.05），失水率和滴水损失呈二次曲线下降（=0.01 和<0.01）。与其他各组相比，添加0.1%杜仲叶提取物可提高背最长肌24 h 红度值（a*）（<0.01）。由表5 可知，0.2%杜仲叶提取物组股二头肌 pH、a*均高于对照组（<0.01），剪切力低于其他组（<0.01）。

表4 杜仲提取物对育肥猪背最长肌肉品质的影响（n=8）

表5 杜仲提取物对育肥猪股二头肌肉品质的影响（n=8）

2.3 杜仲叶提取物对猪背最长肌和股二头肌肌肉化学组成的影响 由表6 可知，与对照组相比，添加0.1%杜仲叶提取物提高了背最长肌干物质和CP 含量（<0.01和<0.05）。杜仲叶提取物的添加水平从0% 增加到0.2%，背最长肌的IMF 和IMP 含量呈二次曲线上升（<0.01 和<0.05）。此外，添加0.1%杜仲叶提取物也提高了股二头肌干物质、CP 和IMF 含量（<0.01 或<0.05）。

表6 杜仲提取物对育肥猪肌肉化学组成的影响（n=8）

2.4 杜仲叶提取物对肌肉中呈味氨基酸含量的影响 由表7 可知，杜仲叶提取物添加水平从0%增加到0.2%，育肥猪股二头肌中天冬氨酸及丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸含量呈二次曲线上升（<0.05、<0.01）；当添加0.2%杜仲叶提取物时育肥猪股二头肌中天冬氨酸、丝氨酸和谷氨酸等鲜味氨基酸含量均可提高（<0.01），天冬氨酸、丝氨酸、脯氨酸和缬氨酸等甜味氨基酸含量也均提高（<0.01）。

表7 杜仲叶提取物对育肥猪肌肉中呈味氨基酸的影响（n=8） μg/g

2.5 杜仲叶提取物对育肥猪抗氧化性能的影响 由表8可知，血清GSH-Px 和SOD 活性随杜仲叶提取物含量的增加呈线性增加（<0.01），血清T-AOC 呈二次曲线增加（<0.05），且三者活性在0.2%杜仲叶提取物组中最高。MDA 浓度随杜仲叶提取物添加水平的增加呈线性下降（<0.01），且在0.2%杜仲叶提取物组中最低。日粮添加0.1%、0.2%、0.3%杜仲叶提取物均能提高育肥猪肝脏T-AOC，且0.1%杜仲叶提取物组高于其他组（<0.01）。随杜仲叶提取物添加水平的增加，肝脏GSH-Px 和SOD 活性呈二次曲线增加（<0.01），MDA 浓度呈二次曲线减少（<0.01）。

表8 杜仲叶提取物对育肥猪血清和肝脏抗氧化指标的影响（n=8）

2.6 杜仲叶提取物对肝脏抗氧化相关基因mRNA 表达水平的影响 由图1 可知，与对照组相比，日粮添加0.1%、0.2%、0.3%杜仲叶提取物均能上调mRNA的表达（<0.05）。0.2% 杜仲叶提取物组肝脏mRNA 表达水平高于其他各组（<0.05）；与对照组和0.3%杜仲叶提取物组相比，日粮添加0.1%和0.2%杜仲叶提取物均上调了育肥猪肝脏的mRNA 表达（<0.05），且0.1%杜仲叶提取物组上调的程度高于0.2%杜仲叶提取物组（<0.05）。

图1 日粮添加不同水平杜仲叶提取物对育肥猪肝脏抗氧化关键基因mRNA 相对表达水平的影响（n=8）

3 讨 论

3.1 杜仲叶提取物对生长育肥猪生长性能的影响 杜仲叶提取物中主要生物活性物质绿原酸具有较好的抗菌、抗病毒、抗氧化等生理功能，黄酮类、多酚类活性成分可提高猪消化吸收能力。本研究结果显示，与对照组相比，0.1% 杜仲叶提取物组育肥猪全期ADFI 有增加的趋势，而添加0.2% 和0.3% 杜仲叶提取物没有显著改善效果，表明低剂量杜仲叶提取物能改善猪的食欲，可能与其中含有的环烯醚萜有关（如京尼平苷），具有促进胆汁分泌的作用。添加1 500 mg/kg 杜仲叶提取物能提高生长猪的生产性能，且随着添加水平的增加，生长猪ADFI 有所提高。但也有研究表明，杜仲叶提取物对断奶仔猪和育肥猪的生长无显著促进作用，其原因可能是由于杜仲叶中强烈的芳香族化合物影响了适口性。由此可见，不同制作工艺及添加量对不同阶段猪的生长性能均有影响，低剂量添加对育肥猪生长性能有促进作用，添加量过大可能会降低适口性从而影响猪的生长。

3.2 杜仲叶提取物对育肥猪肉品质的影响 猪肉品质主要包括感官指标和化学组成等。目前的研究结果表明，杜仲叶粉及杜仲叶提取物能增加育肥猪眼肌面积，提高肌肉嫩度，降低滴水损失，改善猪肉pH 及肉色和大理石纹评分。本试验中，添加0.1% 和0.2% 杜仲叶提取物降低了背肌滴水损失，增加了其保水性；添加0.1%杜仲叶提取物同时增加了背最长肌和股二头肌a*值。Zhou 等研究结果表明，在育肥猪基础日粮中加入0.08%杜仲多酚提取物可提高慢速氧化型肌纤维关键基因的表达，同时下调了快速酵解型肌纤维关键基因的表达，并显著提高猪肉屠宰后pH和a*值。推测杜仲对猪肉品质的改善作用可能与其中所含有的多酚类物质有关。

肉的风味与其中含有的肽类、游离氨基酸（FAA）、肌苷酸（IMP）和无机盐类等物质呈正相关，其中IMP 是构成猪肉鲜味的重要基础，IMP 能增强谷氨酸的鲜味，并抑制酸味和苦味氨基酸。IMP 含量与pH、L*、a*和IMF 等指标具有显著相关关系，说明IMP 含量与猪肉品质具有显著相关性。段明房等研究表明，杜仲叶提取物可通过增加IMP 含量提高猪肉的风味。本研究结果也显示，0.1% 杜仲叶提取物可显著提高生长育肥猪肌肉a*值和IMP 含量；日粮添加0.3%发酵杜仲叶粉也能增加育肥猪肌肉中的IMP 含量。氨基酸是猪肉重要的滋味物质，FAA 与IMF 已经作为畜禽肉类产品风味物质评价的重要指标，在畜禽肉品质检测中广泛应用。在育肥猪日粮中添加杜仲叶提取物，可影响动物机体蛋白质代谢，并显著提高猪肉鲜味氨基酸的含量。本研究中，日粮中添加0.2%杜仲叶提取物能显著提高育肥猪中天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸等鲜味氨基酸的含量，同时提高天冬氨酸、丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸等甜味氨基酸的含量，其原因可能是鲜味氨基酸和IMP 与舌前部的T1R1/T1R3 鲜味受体蛋白相互结合，增强鲜味传导作用，从而对鲜味的呈现产生协同效应。肌内脂肪含量也可直接影响猪肉品质，尤其是肉的风味、嫩度和多汁性。本研究显示，日粮中添加0.1% 和0.2% 杜仲叶提取物均能显著提高IMF。综上所述，杜仲叶提取物可以通过提高肌肉感官指标及风味物质含量来增加肉的风味，提高猪肉品质。

3.3 杜仲叶提取物对育肥猪抗氧化性能的影响 除了对猪肉品质有良好的改善作用外，杜仲及其提取物还有较强的抗氧化能力，可以通过调节抗氧化酶体系来发挥其调节作用。王鑫等研究表明，仔猪日粮中添加250 mg/kg 杜仲叶提取物能显著提高断奶仔猪血清SOD和GSH-Px 活性，显著降低肝脏MDA 浓度。饲粮中添加3%、4%杜仲叶粉可显著提高育肥猪肝脏中GSH-Px活性，极显著降低肝脏中MDA 浓度。本研究显示，日粮添加0.2%杜仲叶提取物可显著增强血清和肝脏中GSH-Px 和SOD 活性，并降低MDA 浓度，提示添加杜仲叶提取物增强了机体的抗氧化能力。杜仲及其提取物能抑制亚铁离子（Fe）诱导MDA 的形成，缓解脂质过氧化，从而改善肉色，增强保水性，起到改善猪肉品质的作用，表明抗氧化性能的提高对肉品质的改善有积极作用。杜仲叶提取物除了通过增加酶活性来增强抗氧化能力外，还能通过调控抗氧化相关基因mRNA的表达水平来发挥抗氧化作用。日粮添加1 000 mg/kg杜仲叶提取物能显著上调肌肉中mRNA 的表达，改善肌肉的氧化状态。本研究结果也表示，杜仲叶提取物可显著上调肝脏和mRNA 的表达水平。杜仲的抗氧化作用主要与其含有的生物活性物质相关，杜仲中的绿原酸和黄酮类等物质均具有良好的清除自由基的能力，其中绿原酸还能通过调控NRF2/ARE信号通路、NRF2/HO-1 信号通路和FOXO 家族基因等，加强机体抗氧化防御体系，NRF2 信号通路在杜仲黄酮调节仔猪肠道氧化应激中起重要作用。本研究中，日粮中添加0.1% 和0.2% 杜仲叶提取物均能显著上调mRNA 的表达，但杜仲叶提取物是否激活了NRF2 信号通路还需要后续研究。综上所述，杜仲叶提取物是通过调节抗氧化酶活和上调抗氧化相关基因的表达发挥其抗氧化作用，以及通过改善机体抗氧化性能进一步提高猪肉品质。

4 结 论

本研究结果表明，杜仲叶提取物对育肥猪的ADFI有增加趋势，且可增加IMP、鲜味和甜味氨基酸等风味物质的含量，改善猪肉品质；杜仲提取物还可通过提高抗氧化相关酶的活性和上调抗氧化相关基因的表达水平发挥抗氧化作用。在本试验条件下，日粮中添加0.1%～0.2%杜仲叶提取物的饲喂效果较好。